TaKaRaPrimeScriptTMOneStepRT-(Onestep)RT-PCR法。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中连续进行,反应中途不需添加任何试剂。实验操作配制RT-PCR反应液,以n个反应管为例。首先,配制如下混合体系,混匀后分加到n个PCR反应管中。RNaseFreedH2O20μIX(n+1)2x1StepBuffer25μIX(n+1)PrimeScript1StepEnzymeMix2μIX(n+1)其次,向PCR反应管中加入欲检测病原的扩增引物(即上下游引物)和样品抽提RNA。上游引物1μI下游引物1μI样品RNA1μI总体系:-PCR反应50℃30min94℃2min94℃30sec50~65℃(以相应的引物而定)30sec 30循环72℃1min72℃10min试剂盒自带有确保试剂有效性的阳性对照RNA以及相应的扩增引物(PositiveControlRNA,ControlF-1Primer,ControlR-1Primer),扩增产物为462bp。扩增后如果试剂盒阳性对照电泳结果为阳性说明试剂盒所有试剂有效,RT-PCR反应液体系没问题。
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