重组质粒的筛选和鉴定-李双男.docx

分子生物化学实验重组质粒的筛选和鉴定学生姓名 李双男学号 20162012049专业 农业资源与环境年级、班级 2016 级所在学院 农学院                        转化或转导 电穿孔或显微注射重组质粒的筛选和鉴定摘要:本实验目的为熟悉 α 互补筛选的原理,并且掌握重组子筛选的方法和重组子鉴定的方法。从大肠杆菌中分离质粒 DNA 方法众多,本实验采用试剂盒提取重组 DNA。采用 PCR扩增检测法和琼脂糖凝胶电泳分析进行实验,得出筛选结果并进行分析讨论,提出了对本实验的展望。关键词:重组质粒;PCR;氨苄青霉素;LB 培养液0 前言为熟悉 α 互补筛选的原理,并且掌握重组子筛选的方法和重组子鉴定的方法。转化体的筛选是利用载体选择性的遗传标记,主要是不同抗生素基因筛选。重组质粒的鉴定常用α-互补、质粒酶切、PCR、分子杂交等方法。α 互补筛选的原理是载体上 LacZ’的 5’端有一段多克隆位点(MCS)区,本身虽不干扰 LacZ’的合成,但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成,不能互补[1]。由于在含抗生素平板培养基上长出的白斑不一定是期望的重组质粒,所以重组质粒的鉴定。应用 PCR 扩增检测法,其原理为 PCR 能在模板序列上扩增出预期 DNA 片断。直接电泳法是利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的原理。限制性核酸内切酶酶切法是根据已知的外源 DNA 序列的限制性酶切图谱,选择一两种内切酶切割质粒,电泳后比较电泳结果(DNA 带数和长度)[2]。是否符合预计的结果。PCR 扩增检测法是根据 PCR 能在模板序列上扩增出预期 DNA 片断。质粒 PCR筛选法将菌落 PCR 筛选法初步鉴定出的单菌落,接种于含有 Amp(Kan)的 LB 培养基中,37℃摇菌培养过夜,利用碱裂解法(或试剂盒)进行质粒的小量提取。独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子,是一种环状的双链 DNA 分子称为质粒(Plasmid) 。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。质粒类型总共分为两种类型,第一种严谨型,这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的,与寄主细胞的复制偶联同步[3]。所以,往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝;第二种松驰型,这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的,每个细胞中含有 10-200份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒 pBR322 即属于松弛型质粒,要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒结构主要有三大要素: 多克隆位点、选择标记、独立的复制单位。从大肠杆菌中分离质粒DNA 方法众多,目前常用的:碱裂解法、煮沸裂解、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法和酸酚法等[4]。选择哪一种方法主要取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求这几个因素。其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒 DNA 可用于酶切,连接与转化,本实验采用试剂盒提取重组 DNA。1 实验技术路线外源 DNA 载体 DNA连接重组分子原核细胞 真核细胞受体细胞扩增或表达 表达2  材料氨苄青霉素(Amp)、LB 培养液、PCR 反应体系、试剂盒、 仪器旋涡混合器,微量移液取样器,离心管,双面离心管架,水浴锅,制冰机,摇