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重组质粒DNA克隆的筛选和鉴定
重组质粒DNA转化宿主菌之后,就需要从大量的菌落中挑选含有重组质粒DNA的克隆。因为,即使我们用转化效率比较高的细菌突变株作为受体菌,也不能使全部细胞转化成功。因此,筛选是基因工程研究工作中必不可少的过程。一般情况下,可通过以下三种主要途径进行筛选。①遗传学方法:即根据重组DNA转化后的细菌细胞具有某种特殊的遗传性状进行筛选。②菌落杂交方法:用体外标记目的基因DNA或相应的RNA为探针同菌落进行原位杂交,筛选含重组DNA的克隆。这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组DNA的克隆。③放射免疫方法:这种方法实际上是通过检测目的基因的表达产物,筛选含有重组DNA的克隆。此法需要制备标记的特异性抗体,然后根据抗原(表达产物)只能与特异性抗体形成复合物的原理进行筛选。
从菌落中筛选到所需要的含有重组DNA的克隆之后,必须对重组DNA作进一步的分析和鉴定,这包括分析重组DNA的分子量以及目的基因插入载体的部位和方向是否正确。有时还需要对目的基因所表达的多肽的分子量和生物活性进行全面分析和鉴定。只有通过这些鉴定工作,才能最终验证我们所设计的研究方案是否成功。
一、重组质粒DNA克隆的初步筛选
从转化后得到的大量菌落中初步筛选可能含有重组DNA克隆,最简便快速的方法是与微生物技术配合的遗传学方法。目前经常使用的基因载体都携带选择性遗传标记,或具有一种可供选择的遗传学特性。例如常用的质粒载体一般具有抗药性标记或营养标记,应根据这些标记初步筛选含重组DNA的克隆。在实际工作中最常使用的方法是利用载体插入失活和
α互补的性质进行筛选。
(一)插入失活有一些质粒载体带有两个或两个以上的抗生素抗性基因。当外源DNA插入其中一个抗性基因序列内部时,由于基因编码序列受到破坏,常导致此种抗性的消失。这一现象即为插入失活。以pBR322为例子,说明利用插入失活现象进行重组克性筛选的基本原理。质粒pBR322是分子克隆中使用最广泛的基因载体之一。它具有两个抗药性标记,一个是氨苄青霉素(Ap)抗性,另一个是四环素(Tc)抗性。用质粒pBR322作基因载体时,常常是将外源基因插入其中一个抗性基因中,外源基因插入后,则引起这个抗性基因失活,在转化受体菌细胞后,可直接在平板培养基上筛选单抗性克隆。例如,外源基因插入BamHⅠ位点后,引起Tc抗性基因失活,转化后的受体菌细胞直接涂布到含有Ap的平板培养基上。在Ap培养基上,不具有Ap抗性的受体菌细胞不能生长。在氨苄青霉素存在下生长的菌落,一些含有重组质粒,而另一些可能含有无外源DNA而在连接过程中自身环化的质粒DNA。为区别两种转化体,培养过夜后,再将转化后的细胞形成的菌落按相同顺序接种到含有Ap和Tc的平板培养基上。在Ap培养基上生长而在Tc培养基上不能正常生长的单抗性菌落,即可能是含有重组DNA的克隆。在两种抗生素培养基上都能生长的双抗性菌落,则是载体pBR322DNA自身连接后细胞所形成的菌落。这样可以方便地初步选出所期望的克隆。
(二)α互补现在使用的许多载体(如M13系列和pUC系列)都带有一个大肠杆菌乳糖操纵子的部分序列,含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和N-末端的前146个氨基酸的编码顺序。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并不破坏读码框架。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性,但它们可以融为一体,形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补,这种互补现象叫α互补。由α互补而产生的Lac+细菌易于识别,因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)存在下形成蓝色菌落或噬斑。然而外源DNA片段插入到质粒或噬菌体的多克隆位点后,几乎不可避免地导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此,带重组质粒的细菌形成白色菌落或噬斑。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落,并识别可能带有重组质粒的菌落。然后通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析,就可以确证这些质粒的结构。
根据基因载体的遗传学特性进行筛选常常可达到事半功倍的效果。因此,重组DNA转化受体细胞后,一般先利用基因载体的遗传特性进行初筛,然后再进行进一步的筛选和鉴定。除去利用基因运载体的遗传学特性进行筛选外,有时也可利用外源基因的遗传学特性进行筛选。如果含有外源基因的重组体在受体细胞内得到了表达,并且这个外源基因的表达产物和宿主细胞的营养缺陷株之间有互补作用,则含这种重组DNA的缺陷型受体细胞表现出非缺陷型的遗传学特性,从而可筛选出我们期望的