关于牛膝的活性成分分析.doc

关于牛膝的活性成分分析<P>关于牛膝的活性成分分析</P><P>关键词:牛膝;活性;分析<BR>摘要:目的:寻找牛膝中对成骨样细胞UMR106的增殖有显著促进作用的活性成分。方法:运用薄层、色谱技术等方法进行分离,鉴定。结果分离出3个化合物,结晶Ⅰβ-谷甾醇、结晶Ⅱ胡萝卜苷、结晶Ⅲ蜕皮甾酮。结论:牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱等分离手段进行化学分离,得到3种含量较大的化合物。</P><P><BR>牛膝为苋科牛膝AchyrenthesbidentataBI的干燥根,主产于河南省,也称怀牛膝,具补肝肾,强筋骨的功能。主治腰膝酸痛,下肢萎软。药理学研究表明:牛膝具有保肝、降酶、镇痛、抗炎、增强免疫力及抗衰老作用。其化学成分主要为多糖,齐墩果酸类三萜皂苷和植物甾酮类。根据中医理论,对30种中药提取物进行活性筛选,发现牛膝的甲醇提取物对破骨细胞具有较强抑制作用。进一步研究证实:牛膝正丁醇可溶部分为其活性成分。为了寻找牛膝中显著促进骨样细胞UMR106增殖的活性成分,对牛膝的甲醇提取物的正丁醇可溶部分的化学成分进行研究,分离得到3个已知化合物。<BR><BR>一、材料与方法<BR><BR>1、仪器、试剂及药品<BR>1)仪器<BR>JJascoPU-980高效液相色谱输液泵(日本分光公司),JascoUV-975紫外-可见检测器(日本分光公司);CKChrom色谱工作站(ScientificSystemInc.),CX-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂),1H-NMRBrukerARX-300(300MHz)核磁共振仪。<BR>2)试剂<BR>乙腈(色谱纯),天津四友生物医学技术有限公司提供;硅胶,青岛海洋化学试剂厂提供。<BR>3)药材<BR>牛膝购自辽宁省沈阳市中药材公司,经鉴定为AchyranthesbidentataBI。之干燥根对照品β-谷甾醇、胡萝卜苷、蜕皮甾酮对照品由天然药化研究室提供(纯度均&gt;90%)。<BR><BR>1)牛膝药材醋酸乙酯层的提取<BR>,放入圆顶烧瓶中,用75%乙醇加热回流提取3次,合并滤液,进一步减压回收溶液得到乙醇提取浸膏。浸膏用水溶液,得到水混悬液。混悬液用石油醚萃取,萃取后保留石油醚层,放入棕色瓶中,混悬液用氯仿萃取,得到氯仿层。混悬液用正丁醇和醋酸乙酯萃取,分别得到了醋酸乙酯和正丁醇层及水层。顺利完成了提取工作。<BR>2)牛膝醋酸乙酯层的分离<BR>取牛膝醋酸乙酯层浸膏适量,用石油醚-丙酮进行梯度硅胶柱层析,溶剂梯度变化顺序为:石油醚-丙酮(200∶1)、石油醚-丙酮(100∶1)、石油醚-丙酮(50∶1)、石油醚-丙酮(20∶1)、石油醚-丙酮(10∶1)、石油醚-丙酮(5∶1)、石油醚-丙酮(3∶1)、石油醚-丙酮(2∶1)、石油醚-丙酮(1∶1)、丙酮,每个溶剂梯度用5个层析硅胶柱的保留体积洗脱,每250ml为一馏分,各馏分回收溶剂后,用硅胶GF254薄层板检验各馏分成分,合并主要成分相同的馏分。<BR>当洗脱溶剂为石油醚-丙酮(10∶1)时,收集馏分60-66,用硅胶制备薄层进行制备,以石油醚-丙酮(5∶1)为展开系统,氯仿-甲醇重结晶得化合物Ⅰ。<BR>当洗脱溶剂为石油醚-丙酮(2∶1)时,收集馏分192-199,经硅胶制备薄层进行制备,以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)为展开系统,氯仿-甲醇(1∶1)重结晶得化合物Ⅱ。<BR>当洗脱溶剂为丙酮时,收集馏分202-214,经硅胶制备薄层进行制备,以醋酸乙酯-甲醇(4∶1)为展开系统,甲醇重结晶,反相高效液相色谱制备,以水-乙腈-四氢呋喃(86∶11∶3)为流动相,得化合物Ⅲ。<BR>,配成1mg/ml的储备液,进行细胞的增殖检测实验时,×10-2,×10-3,×10-4,×10-5,×10-6,×10-7mg/ml6个浓度。<BR><BR>二、结果<BR><BR>牛膝中分离得到的3种化合物的鉴定:化合物Ⅰ:白色针晶,mp139~142℃,Liebermann-Burchard反应阳性,用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时:①石油醚-丙酮(5∶1);②环己烷-醋酸乙酯(5∶2);③氯仿-石油醚-醋酸乙酯(8∶6∶1),和对照品β-谷甾醇Rf相同,和对照品混合后熔点不降低。故鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol)。<BR>化合物Ⅱ:白色粉末,mp303~305℃,Libermann-Burchard和Molish反应均为阳性,用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时:①甲醇-醋酸乙酯-