巯基亚硝基化修饰与蛋白质组反应特征.pdf

山东大学博士学位论文幽门螺杆菌在NO压力下的巯基亚硝基化修饰及蛋白质组反应特征姓名:曲伟申请学位级别:博士专业:病原生物学指导教师:贾继辉20090518山东大学博士学位论文幽门螺杆菌在N0压力下的巯基亚硝基化修饰及蛋白质组反应特征专业:博士生:导师:摘要病原生物学曲伟贾继辉教授幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,且pylori)是一种革兰氏阴性、螺杆状的微需氧菌,定植于人胃粘膜上皮细胞,可导致慢性胃炎、消化性溃疡,胃粘膜相关淋巴组织(MAIT)淋巴瘤及胃癌的发生,1994年世界卫生组织国际癌症研究机构(Ld眦)已将其列为I类致癌因子。幽门螺杆菌在定植胃粘膜后可以激活人体免疫系统,包括局部性和全身性抗体反应、细胞介导的免疫反应等。临床资料及动物实验表明这些先天性和继发性免疫反应对幽门螺杆菌具有一定的清除能力,如果能够充分地理解它们对幽门螺杆菌的免疫杀伤作用,就可以为新型抗幽门螺杆菌制剂的开发提供重要线索。一氧化氮(nitricoxide,NO)分子是具有抗菌作用和免疫调节活性的重要的效应分子,它的L一精氨酸合成途径有赖于一氧化氮合酶(NOS)的催化作用,OS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)两类。其中,在感染、炎症以及一些生理状态下,iNOS可表达于多种细胞。当iNOS表达后,能持续生成大量的NO,在机体的免疫过程中,尤其是抗感染免疫中发挥重要的作用。因此,NO是当今生物学和医学领域中比较热门的研究课题之一,在微生物学领域,NO的研究也十分活跃。众所周知,半胱氨酸(含巯基,结构式为HS.)在多种蛋白功能中发挥重要作用。NO与巯基之间形成共价键的过程被称为巯基亚硝基化修饰。这种修饰与多种生理和病理过程密切相关,例如平滑肌舒张、神经递质传递和免疫防御等。山东大学博士学位论文目前比较常用的分析巯基亚硝基化蛋白质特征的方法是生物素转换法,并借助抗体法或质谱技术来进一步研究发生巯基亚硝基化的蛋白质。将活性巯基进行亚硝基化修饰是NO损伤病原体的重要机制,因此,针对巯基亚硝基化的分析方法非常适合研究免疫分子NO对微生物的作用靶点。基因组学和蛋白质组学技术都是整体的高通量的生物技术体系,它们的兴起推动了生命科学各个分支突飞猛进的发展。基因是遗传信息的携带者,蛋白质才是全部生物功能的执行者,由于转录后调控和翻译的影响,mRNA水平的变化不能完全反映蛋白质丰度的变化。而蛋白质组学是在整体水平上高通量地对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体进行研究的技术体系,已被证实是研究细菌应对各种环境压力的适应反应的有力工具。幽门螺杆菌的两个菌株(月=pylort26695和HpyloriJ99)的全基因组序列已经测序完成,为了充分利用这些生物信息学资源,本研究应用生物素转换法和高通量的比较蛋白质组学方法分析了NO对幽门螺杆菌蛋白质的巯基亚硝基化修饰和幽门螺杆菌在NO压力下的蛋白质表达的变化情况,旨在发现幽门螺杆菌抗逆生存的新机制。该课题主要研究内容及实验结果如下:一、一氧化氮对幽门螺杆菌菌体蛋白巯基亚硝基化修饰及其抑菌作用当幽门螺杆菌感染人体后,它可以激活宿主的先天性和继发性免疫反应,其中,NO是一种重要的非特异性免疫效应分子,目前尚无研究分析NO等活性氮类物质(RNS)对幽门螺杆菌的抑菌活性,而RNS对抗病原微生物的一个主要的作用机制是将重要生命蛋白的活性半胱氨酸氧化和亚硝基化,使茵体蛋白功能弱化或丢失。然而,RNS对幽门螺杆菌的靶蛋白尚不清楚。本实验首次在体外实验检测了NO对幽门螺杆菌的较强的抑菌和杀菌活性,分析了幽门螺杆菌在应用NO供体GSNO处理后蛋白质发生巯基亚硝基化的情况。即将幽门螺杆菌的菌体蛋白质与GSNO孵育后,用生物素转换法(BSM)标记发生巯基亚硝基化的蛋白,然后再进行纯化、凝胶电泳分离,。明确地鉴定了五种发生巯基亚硝基化的蛋白质,分别为:伴侣分子及热休克蛋白(GroEL)、尿素酶Ct亚基(UreA)、烷基氢过氧化物还原酶(TsaA)、HP0721和HP0129,这初步揭示了RNS对幽门螺杆菌的可能的2山东大学博士学位论文抑菌机制:通过对蛋白质的巯基亚硝基化修饰靶定、抑制细菌的抗氧化防御功能以及粘附、定植能力等。二、幽门螺杆菌在一氧化氮压力下的蛋白质组反应特征幽门螺杆菌具有多种策略逃逸先天性免疫反应,经由NOS途径合成的NO等活性氮类物质是先天性免疫反应中的重要效应分子。然而,幽门螺杆菌如何在NO压力下存活的机制至今尚未完全阐明。本实验应用蛋白质组学的方法分析了幽门螺杆菌在亚硝基化压力下的蛋白质反应特征。利用比较蛋白质组学的方法筛选到38个受NO供体(硝普钠)调节的蛋白质。这些蛋白质分别参与蛋白质处理过程、抗氧化、一般性压力反应、毒力因子以及一些未知功能等。值得注