2020年16S rDNA鉴定细菌的方法.doc

2020年16S_rDNA鉴定细菌的方法16SrDNA鉴定细菌的方法细菌16SrDNA鉴定主要分为7个部分:,,电泳检测纯度与大小。。。试剂:培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也能够在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。1MTris-HCl(,,)(1L):Tris,加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1℃,。(Tris-HCl缓冲液(,25℃) 50ml三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与xml,加水稀释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)EDTA()(1L):Na2EDTA•2H2O,(约20g),高温高压灭菌,室温保存。(•2H2O,置于1L烧杯中。,充分搅拌。3.(约20gNaOH)。注意:,EDTA才能溶解。。,高温高压灭菌。。)10×TEBuffer(缓冲液)(,,)(1L):组分:100mMTris-HCl,10mMEDTA。1MTris-HCl(,,)取100ml,EDTA()取20ml。高温高压灭菌,室温保存。1×TEBuffer用10×TEBuffer稀释10倍即可。10%SDS(W/V):称10gSDS,68℃加热溶解,。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。6、5MNaCl:,高温高压灭菌,4℃保存。7、CTAB/NaCl(10%CTAB,NaCl):NaCl,加10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。用之前在65℃溶解。8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液:使用液1×:mol/LTris-乙酸,mol/LEDTA。浓储存液50×:242gTris,ml冰醋酸,100mlmol/LEDTA()。11、6×上样缓冲液(100ml):%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10mmol/LEDTA()(ml),4℃保存。12、%琼脂糖凝胶:ml。13、EB:10mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。。当配置50ml。(因EB是剧毒物质,当前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)14、蛋白酶K:20mg/ml溶于水,-20℃保存,反应浓度50ug/ml,反应缓冲液:mol/LTris(pH),mol/LEDTA,5%SDS,反应温度37-56℃。无需预处理。15、RNaseA:10mg/ml。25mgRNaseA加1MTris(pH)25ul,NaCl15ul,无菌水2460ul,于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。)基本步骤:材料准备破碎细胞或胞膜—内容物释放核算分离、纯化沉淀或吸附核酸,并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主