icengineeringDefinition基因工程(icengineering,又称为遗传工程)是利用DNA重组技术,将目的基因与载体DNA在体外进行重组,然后把这种重组DNA分子引入受体细胞,并使之增殖和表达的技术1)跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖2)无性扩增外源DNA在宿主细胞内可大量扩增和高水平表达。icengineering**基因工程的基本原理基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达(1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性,将外源基因与载体分子重组,通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量,借此提高其宏观表达水平。icengineering**(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件,强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。(4)工程菌(细胞)大规模培养的工程和工艺角度切入,合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量,也是提高外源基因表达产物的主要环节,(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件,并将这些元件与外源基因精细拼接,通过强化外源基因的转录提高其表达水平。icengineering重组DNA技术操作过程为:icengineering常用的工具酶限制性内切核酸酶(restrictionendonucleases)DNA连接酶(DNAligase)DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)反转录酶(reversetranscriptase)DNA末端转移酶(DNAterminaltransferase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体催化DNA切口平移反应,制备高比活探针;DNA末端标记,合成cDNA的第二链催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’-OH末端上以RNA为模板合成互补的cDNA链线性双链或单链DNA分子的3’-OH末端加上同聚物尾去除DNA,RNA,dNTP的5’icengineering一、目的基因的获取(1)提取DNA后,PCR体外特异扩增(2)以mRNA为模板,反转录合成cDNA。(3)化学合成基因(4)限制性内切酶从载体上切取(5)构建基因文库,icengineering二、icengineering
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