DNA提取方法.doc

教学实习内容一. 鸡新城疫的免疫检测目的:系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。实验材料: 新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、 5% 柠檬酸钠、 1% 鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、 15ml 离心管、试管、 96孔V 型板、离心机等 % 鸡红细胞悬液的制备(1) 每组采取 3ml 左右健康鸡静脉血, 迅速注入装有约 - 抗凝剂的离心管内, 轻轻颠倒混匀; (2 )加入适量生理盐水,混匀, 3000rpm*10min ,吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层(3 )加入适量生理盐水,重悬红细胞, 3000rpm*10min ,吸弃上清液。如此,重复 3 次。(4 )量取红细胞沉淀的体积,用生理盐水配成 1% 的红细胞悬液,待用。 试验根据所用 NDV 液的凝集价,配制 4 单位病毒液。 试验(1) 待测卵黄样品的制备: 用镊子敲破鸡蛋小头, 将蛋清倒去, 留蛋黄在蛋壳内; 吸取 l 生理盐水,放入小试管内;去掉部分蛋壳,用 1ml 注射器(不带针头)吸取蛋黄 ,加到有生理盐水的试管内,混匀(避免其很多泡)待检。(2 )按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。 1% 红细胞(3 )判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。结果与分析对所测得的结果进行分析, 确定该鸡群目前的免疫状态, 并对生产提出合理建议或给出科学指导。分析并指出影响本实验结果的主要因素。—— PCR 检测(以 PCV2 为例) 提取: 将猪肝脏称重后,按照 1:3(W:V )的比例加入 PBS , 用组织研磨器研磨成组织悬液, 反复冻融 3 次后 8000 rpm 离心 5 min ,取上清 300 μL 提取 DNA 。取冻融、离心后的组织悬液/ 血清 300 μL, 加入 300 μL 细胞裂解缓冲液和 5μL 的蛋白酶 K(20 mg/mL) , 混匀,置 50℃消化 2h, 每隔 30 min , 剧烈震荡一次; 加入等体积的 Tris 饱和酚, 充分振荡混匀,4℃ 12000 rpm 离心 10 min ; 取上层水相转入一新的 mL eppendorf 管中, 加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇( 25:24:1 ) 混匀后,4℃ 12000 rpm 离心 10 min ; 用酚: 氯仿: 异戊醇( 25:24: l) 重复抽提一次; 取上层水相转入一新的 mL eppendorf 管中, 加入 2 倍体积冰预冷的无水乙醇和 1/10 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH ), 室温放置 30 min 以沉淀基因组 DNA ;4℃ 12000 rpm 离心 15 min , 弃上清;用 75% 乙醇 1 mL 洗涤沉淀,4℃ 120 00r pm 离心 10 min 后, 弃去上清, 自然晾干。用 25μL含 RNaseA(20 μ g/mL) 的 TE 溶解 DNA 沉淀,直接用于检测病毒 DNA 或-20 ℃保存待测。 检测: 将所提取的 DNA 用特异性引物进行 PCR 扩增检测