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dna 提取方法制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤, 通常要求得到的片段的长度不小于 100-200kb 。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素, 以保证 DNA 的完整性, 为后续的实验打下基础。主要是 CTAB 方法, 其他的方法还有 1 物理方式: 玻璃珠法, 超声波法, 研磨法, 冻融法。 2 化学方式:异硫氰酸胍法, 碱裂解法 3 生物方式: 酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤: 1 、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2 、细胞重悬于冰冷的 PBS 漂洗一次,离心收集。试验步骤 2 再重新作一边。 3 、加入 5mlDNA 提取缓冲液, (10mmol/LTris-cl,,%SDS), 混匀。 4、加入 25ul 蛋白酶 K, 使终浓度达到 100ug/ml, 混匀, 50℃水浴 3h, 5、用等体积的酚抽提一次, 2500rpm 离心收集水相, 用等体积的(酚, 氯仿,异戊醇)混合物抽提一次, 2500r/min 离心收集水相 6、用等体积的氯仿, 异戊醇抽提一次。加入等体积的 5mol/L 的 LiCL, 混匀,冰浴, 10min. 。 7、 2500rpm 离心 10min. 转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温 10min 。 2500rpm, 离心 10min 。弃上清。 8、加入 倍体积 3mol/L 乙酸钠() 与2 倍体积-20 ℃预冷无水乙醇。-20 ℃ 20min 。 9、 12000r/min, 室温离心 5min 。弃上清。将 DNA 溶于适量 TE 中。外周血 DNA 提取技术分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1 、取人肘静脉血 5ml , EDTA 抗凝, 2500rpm 离心 10min 。 2 、小心吸取上层血浆,分装到 3个 离心管中。 3 、在血细胞中加入 3 倍体积的溶血液,摇匀,冰浴 15min 。 4、 2500rpm 离心 10min ,弃上清。 5 、加入 10ml 溶血液,摇匀,冰浴 15min 。 6、 3000rpm 离心 10min ,弃上清。 7 、倒置离心管,去掉残液。 8 、得白细胞,- 80?C 冻存。试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过 2h,4℃放置不超过 5h ,以防白细胞自溶。氯仿法抽提外周血白细胞基因组 DNA : 试验试剂: Ligsisbuffer : ;最后加灭菌去离子水至 1000ml ,高压灭菌。 ACD 抗凝剂:柠檬酸 柠檬酸钠 葡萄糖 ;最后加灭菌去离子水至 350ml ,高压灭菌。提取缓冲液( Extractionbuffer ): 10mMTrisCl(PH=)(PH=)(PH=) MEDTA(PH=)%SDS10% ;最后加灭菌去离子水至 100ml ,高压灭菌试验步骤: 1、在 500 μl 抗凝血中加入 ligsisbuffer1000 μl, 充分颠混至清亮。以 4000rpm ,离心 5min 。弃上清液。 2、沉淀中加入 ligsisbuffer1500 μl, 充分匀浆。以 6000rpm ,离心 5min 。 3 、彻底弃去上清,加入 extractionbuffer500 μl (裂解细胞) ,混匀置于 37℃,水溶 1h。 4、加入 8μl 的蛋白酶 K, 颠混, 37℃过夜(或 55℃, 3h, 但是 37℃效果要好些)。 5、每管加入 450 μl 饱和酚( 取溶液下层) 缓慢摇晃 10min ,以 5500rpm , 离心 15min 。 6 、取上清,每管加入 250 μl 饱和酚和 250 μl 氯仿-异戊醇,摇匀 10min ,以 5500rpm ,离心 15min 。 7、取上清, 每管加入 500 μl 氯仿-异戊醇, 摇匀 10min ,以 5500rpm , 离心 15min 。 8 、取上清,每管加 50μl的 3M的 NaAC +,适量无水乙醇(预冷) 至满,摇匀放入-20 ℃保存 2h 以上。 9 、以 12000rpm ,离心 20min 。去上清,加入 70 %乙醇 500 μl,以 12000rpm ,离心 5min ,去上清, 50- 60℃干燥。 10 、加入 50μl 灭菌去离子水,转弹,混匀。 NaI 提取法提取外周血白细