死活细胞的鉴别.doc

(一)、死活细胞鉴别生活细胞近似无色透明,用普通光镜无法观察其形态,需用相差显微镜来观察。染色排除法:组织培养中检查死活细胞最常用是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格,它只能判断细胞代谢死亡,不反映细胞能否增殖。由于未经过固定、专门染色,所以看不到死活细胞形态差别。所用染料分类:一般生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏,染料才能进入细胞膜。第一类:死细胞着色,使死细胞着色大部分是酸性染料。它们不容易穿透活细胞质膜,进入胞内,但却能渗透死亡细胞,使之着色。如①台盼兰(Trypanblue):-1%台盼兰,-,,2分钟后镜检,活细胞没有染上,死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’black):%苯胺黑以1:10量与细胞悬液混匀,1-2分钟后,死细胞被染成黑色。③伊红Y:细胞悬液与细胞悬液混喝,2分钟后死细胞被染成桃红色。等。第二类:活细胞着色,多为碱性染料,如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小染料,由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定结构上从而显色,即它们解离后带正电,其中有染料可与胞内某些结构专一性结合。①1%结晶紫染色生理1%结晶紫盐水与细胞悬液1:2混合,立即镜检,或细胞被染成蓝紫色,而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒,无物理、化学变化,基本上不影响细胞生命活动。②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前死活状态。丫啶橙是一种与DNA与RNA都能结合荧光染料,在兰光或紫外光激发下,DNA可激发出530nm荧光发射峰,RNA可激发出640nm荧光发射峰,它与双链DNA结合方式是潜入双链之间,而与单链DNA与RNA则由静电吸引堆积在磷酸根上。在蓝光激发下,细胞核发亮绿色荧光,核仁与胞质RNAPage9发桔红色荧光。因此,原来活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色,核仁与散布在细胞质中RNA呈桔红色,胞质其余部分为淡红褐色。死亡细胞,因物质发生变形,其核呈暗绿色,胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙阳离子也可以结合在蛋白质、多糖与膜上而发荧光,但由于经过细胞固定抑制了这种结合,从而主要显示出是DNA与RNA两种核酸。本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。(二)细胞核与染色体染色Giemsa染色:姬姆萨是常用染料,可观察核、染色体。醋酸地依红染色:可显示有丝分裂染色体微细结构,如次缢痕、染色质丝螺旋化等。该染料同时具有固定与染色作用,因此也可用来坐快速检查有丝分裂指数。(细胞涂片,-10分钟,使细胞膨胀,染色体分裂;甲醇固定10分钟,空气干燥,滴加2%醋酸地衣红,染10-20分钟后即可观察。(三)细胞器特殊染色1、内质网显示早在1945年,有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞内质网。之后,观察内质网基本是采用电子显微镜。在80年代中开始发展了一些活细胞荧光染料,又称“荧光探针”,为显示细胞内模型结构,包括内质网,提供了新途径。DiOC6(3):是一种亲脂性阳离子荧光染料,可选择性与负电性膜结构结合。在低浓度时仅能染出线粒体,细胞界限不清,较高浓度时(-)内质网染色最佳,而容媒体、高尔基体等均然浅色。2、高尔基体显示在光镜下观察高尔基体可用景点固定染色,也可用活细胞荧光染料。由于高尔基参与分泌这一动