(三)网织红细胞计数.ppt

实验三 网织红细胞计数一、实验原理网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的 RNA 物质,经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后 RNA 中负电荷基团与带正电荷的有色基团结合,凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状或网状结构,可在显微镜下识别。计数 1000 个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百分比, 或×红细胞计数结果报告其绝对值。网织红细胞( Ret ) 是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间的过渡细胞,是尚未完全成熟的红细胞, 其胞浆内残存有嗜碱性的 RNA 物质。嗜碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒,颗粒与颗粒连缀成线,线连接成网,故而得名。 分型:丝球型、网型、破网型、点粒型。(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型) 网织红细胞计数方法?1、普通光学显微镜法:活体染色后推片镜检?2、网织细胞计数仪法:荧光染色后用流式细胞术计数二、试剂器材 1、试剂 10 g/L 煌焦油蓝酒精(水)溶液 2、器材毛细血管采血用具、小试管、载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、 Miller 窥盘或直径约 20 mm (较目镜内径稍小)的圆形硬纸片(正中央开一边长为 3 mm 的菱形或正方形小孔,置目镜光阑处,用于缩视野法计数) 三、操作步骤 1. 染色:于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液 1 滴, 任其自然凉干后备用,取末梢血或抗凝血一滴,于已干燥的染料上,用推片角混匀后,将两玻片盖合(玻片法);试管法取染液 2 滴入试管,加血 2滴混匀,封闭好,待 15 分钟以上时间, 2. 推片:取混合液 1 小滴于载玻片的一端,推制成薄而均匀的血膜, 3. 低倍镜浏览,选取红细胞分布均匀网织红细胞染色较好的部分(体尾交界处),滴香柏油转换至油镜,在 Miller 窥盘下计数小方格中的 RBC 数和大方格中的网织红细胞数(或数出整个视野中的 RBC 总数和其中的网织红细胞数,换一视野同法计数至几个视野 RBC 总数>1000 为止)。 Miller 窥盘 A 3 1 B将Miller 窥盘放在显微镜目镜中,通过窥盘中大小方格间的 9比1比例关系计算 RBC 数和 Ret 数。四、计算 1. Miller 窥盘法:网织红细胞( Retic ) 百分率(%)= (大方格内 Retic 总数) /(小方格内 RBC 总数×9)× 100% 2. 直接计数法:网织红细胞( Retic )百分率(%)= 多个视野内 Retic 总数/多个视野内 RBC 总数× 100% 五、注意事项 1. 用酒精染液时,应待玻璃片上的酒精挥发干燥后,才能加血液,染色时应用推片角不停搅动,使染料和血液混合,防止凝固。 2. 染色时间一定要充足,混合后不能立即推片,室温低时染色时间应适当延长,应覆以另一玻片防止蒸发。 1:1为宜,贫血适当加血量。 ,弓形移动,多个区域计数 ,以免变质沉淀。