细胞培养液的配制.ppt

细胞培养液的配制?培养基的选择依据: 经验、文献、尝试常用: RPMI1640 、DMEM ?培养基的来源市售干粉培养基--- 自己配制液体培养基--- 直接使用(注意有效期) ?培养基的除菌方法过滤除菌: (1) 正压过滤--- 效率高(2) 负压过滤--- 效率低高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺,灭菌后另外添加?培养基附加成分的添加按使用说明或实验要求添加配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等临用前加: 生物活性因子如 EGF 、FGF 、NGF 、 PDGF 等 RPMI1640 培养液配制过程?准备物品(1) 不锈钢过滤器, 滤膜( μm, μm), 磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶(2) 培养粉,1N HCl,NaHCO 3, 青霉素, 链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水?消毒物品滤器中放置 μm 滤膜, 包装, 高压蒸气消毒配制步骤(1) / 包培养粉溶至 1L 三蒸水中, 磁力搅拌20min (2) 加2g NaHCO 3/L, 继续搅拌 10min (3) 加青霉素 100U/mL(80 万U 溶至 4ml 三蒸水, ) 链霉素 100U/mL(100 万U 溶至 5ml 三蒸水, )) (4) 加1N HCl 约3mL, , 继续搅拌(5) 按要求加血清(血清一般需经 56℃, 30min 灭活) 例如: 10% 胎牛血清无血清培养液 900ml 灭活胎牛血清 100ml (6) 正压过滤除菌(气压适当, 防止滤膜破裂) (7) 分装,贮存于 4℃,2周内用完。(8) 无菌试验: 取样, 37 ℃放置 24-72h, 无细菌、霉菌污染方可使用注意事项?谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4 ℃,7d分解5 0%,放置两周以上时,根据需要添加谷氨酰胺。配制100 ×母液( 200 mmol/L, ), 每100ml 加入 -2 ml 母液,终浓度 1-4 mmol/L ?抗生素在 37℃稳定性维持 3-4d, 可控制轻度污染。防污染重在无菌操作培养液配制过程(以 RPMI1640 为例) 1. 物品准备(1)滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、 pH计、贮液瓶等。(2) 培养粉、 NaHCO 3、 1N HCl 、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水