脯氨酸含量测定.doc

植物抗逆性的测定(脯氨酸快速测定法)在逆境条件下(旱、热、冷、冻),植物体内脯氨酸的含量显著增加,Barheff和Naylor(1966年)指出:在水分亏缺的情况下,引起蛋白质分解,而脯氨酸首先大量地被游离出来。植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质体及组织内的代谢过程,因而能降低冰点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒性的生理指标。    (一)原理    磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应,当有磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。    (二)材料及设备    :(1)待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆均可)。(2)722分光光度计,(3)研钵,(4)100ml小烧杯,(5)容量瓶,(6)大试管2支,(7)普通式管8支,(8)移液管;(9)注射器;(10)水浴锅,(11)漏斗,(12)漏斗架,(13)滤纸,(14)剪刀。        (1)酸性茚三酮溶液:,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中。    (2)3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸蒸馏水溶解后定容至100ml。    (3)冰醋酸,(4)甲苯    (三)实验步骤        (1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。    (2)系列脯氨酸浓度的配制    取6个50ml容量瓶,,,,,,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,其每瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,3,4,5,及6μg/ml/    (3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30分钟。    (4)冷却后向各试管准确加入4ml甲苯,振荡30秒钟,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。    (5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长进行比色。    (6)标准曲线的绘制:先求出密度(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/ml)。        (1)脯氨酸的提取:,分别置大试管中,然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提了以10分钟,(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。    (2)吸取2ml提取液二另一干净的带玻璃试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚一桐试剂,在沸水浴中加热30分钟,溶液即呈红色。    (3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30秒钟,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在30