实验三PCR扩增制备目的基因样本.docx

反转录概念   反转录是以RNA为模板,经过反转录酶,合成DNA过程,是DNA生物合成一个特殊方法。区分:反转录和逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中,人为地提取出所需要目标基因信使RNA,并以之为模板人工合成DNA过程;逆转录是RNA类病毒自主行为,在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA过程。二者虽同为RNA→DNA过程,但地点不一样,相对性来说,反转录在体外,逆转录在体内。2 反转录酶和反转录过程   反转录过程由反转录酶催化,该酶也称依靠RNADNA聚合酶(RDDP),即以RNA为模板催化DNA链合成。合成DNA链称为和RNA互补DNA(cDNA)。反转录酶存在于部分RNA病毒中,可能和病毒恶性转化相关。人类免疫缺点病毒(HIV)也是一个RNA病毒,含有反转录酶。在小鼠及人正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶,推测可能和细胞分化和胚胎发育相关。   大多数反转录酶全部含有多个酶活性,关键包含以下多个活性。   ①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不含有3′→5′外切酶活性,所以没有校正功效,所以由反转录酶催化合成DNA犯错率比较高。   ②RNaseH活性;由反转录酶催化合成cDNA和模板RNA形成杂交分子,将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。   ③DNA指导DNA聚合酶活性;以反转录合成第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。    除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性,这可能和病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中相关。反转录酶发觉对于遗传工程技术起了很大推进作用,现在它已成为一个关键工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板,在反转录酶作用下,合成出互补DNA(cDNA),由此可构建出cDNA文库(cDNAlibrary),从中筛选特异目标基因,这是在基因工程技术中最常见取得目标基因方法。反转录简明过程表示以下:    反转录酶作用是以dNTP为底物,以RNA为模板,tRNA(关键是色氨酸tRNA)为引物,在tRNA3′桹H末端上,按5′→3′方向,合成一条和RNA模板互补DNA单链,plementaryDNA,cDNA),它和RNA模板形成RNADNA杂交体。随即又在反转录酶作用下,水解掉RNA链,再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此,完成由RNA指导DNA合成过程。3 生物学意义反转录发觉相关键理论意义和实践意义。(1)对分子生物学中心法则进行了修正和补充,修正后中心法则表示为:是指遗传信息从DNA传输给RNA,再从RNA传输给蛋白质,即完成遗传信息转录和翻译过程。也能够从DNA传输给DNA,即完成DNA复制过程。这是全部有细胞结构生物所遵照法则。一些病毒中RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在一些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA过程(一些致癌病毒)。有些病毒(如阮病毒,即疯牛病病毒)以蛋白质直接形成蛋白质。(2)在致癌病毒研究中发觉了癌基因,在人类部分癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中,也分离出和病毒癌基因相同碱基序列,称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因发觉为肿瘤发病机理研究提供了很有前途线索。(3)在实际工作中有利于基因工程实施。因为目标基因转