免疫共沉淀步骤.docx

具体步骤：
1.
细胞用预冷的 PBS液洗涤 2 次，最后洗涤完成后吸干
PBS液。
2.
加入预冷的 RIPA Buffer （1ml/107 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2培养瓶）。
3.
刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入

管中， EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动 15min 。
4 ℃， 14000g 离心 15min 。
立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备 Protein A 琼脂糖，用 PBS液洗两遍珠子，然后用 PBS液配制成 50%浓度。
为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每 ml 总蛋白中加入 100ul Protein A 琼脂糖珠（ 50%），EP管插冰上， 置于水平摇床上 4℃ 摇晃 10min。
目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。
4 ℃， 14000g 离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中。
测定蛋白浓度，可选用 Bradford 法做蛋白标准曲线。
蛋白定量，分装， -20 ℃保存，可保存 1 个月。
11. 用 PBS液将总蛋白稀释至约 1ug/ml 。
加入 500ul 稀释好的兔抗到总蛋白中。
13.
于摇床上 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置
2h。
14.
加入 100ul Protein A
琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床
4℃缓慢摇动抗原抗体
混合物过夜或者室温孵育
1h。
14000rpm 瞬时离心 5s ，去上清，收集琼脂糖珠 - 抗原抗体的复合物。
16.
用 800ul
预冷 RIPA buffer 冲洗 3 遍。
17.
用 60ul 2
倍上样缓冲液将琼脂糖珠 - 抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。
18. 将上样样品煮 5min。
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