免疫共沉淀步骤.doc

在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
免疫沉淀
1）蛋白提取
（1）取10盘长满10 cm 大皿的Hep G2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。
（2）加预冷的裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）至培养皿中（每皿500-1000 ul），冰上孵育30 min。
（3）用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心13,000 g，10 min。
（4）将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。
2）准备磁珠
（1）将protein A和protein G珠子分别摇晃5 min混悬，各吸取50 ml EP管中，组成100 ul 珠子混合物。
（2）小离心机离心20-30 s，去上清。
3）结合抗体
（1）将肝细胞癌患者血清20 ul 和200 ul Ab Binding & Washing Buffer 加入上述EP管中。
（2）室温旋转10 min孵育。
（3）小离心机离心20-30 s，去上清。
（4）加入200 ul Ab Binding & Washing Buffer，轻柔吹打重悬珠子。
4）免疫沉淀
（1）将上述EP管离心，去上清。
（2）取5 ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。
（3）室温旋转孵育30 min（将抗原结合到珠子-抗体复合物上）。
（4）离心机离心20-30 s，将上清吸入干净离心管备用。
（5）使用200 ul Washing Buffer 清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。
（6）100 ul Washing Buffer 重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。
5）洗脱目的抗原
（1）将EP管离心，去上清。
（2）加20 uL Elution Buffer，轻柔吹悬复合物，避免产生气泡。
（3）室温旋转孵育2 min，分离复合物。
（4）EP管离心，将上清放吸入新EP管备用。
完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎！扯远了
玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的la