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免疫共沉淀步骤
在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
免疫沉淀
1)蛋白提取
(1)取10盘长满10 cm 大皿的Hep G2细胞,弃去培养基,用预冷PBS清洗细胞3次,吸净PBS残液。
(2)加预冷的裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)至培养皿中(每皿500-1000 ul),冰上孵育30 min。
(3)用细胞刮刮取,收集细胞裂解液并移至离心管,4℃离心13,000 g,10 min。
(4)将上清移至新离心管中,可用于蛋白浓度测定或远期研究。
2)准备磁珠
(1)将protein A和protein G珠子分别摇晃5 min混悬,各吸取50 ml EP管中,组成100 ul 珠子混合物。
(2)小离心机离心20-30 s,去上清。
3)结合抗体
(1)将肝细胞癌患者血清20 ul 和200 ul Ab Binding & Washing Buffer 加入上述EP管中。
(2)室温旋转10 min孵育。
(3)小离心机离心20-30 s,去上清。
(4)加入200 ul Ab Binding & Washing Buffer,轻柔吹打重悬珠子。
4)免疫沉淀
(1)将上述EP管离心,去上清。
(2)取5 ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。
(3)室温旋转孵育30 min(将抗原结合到珠子-抗体复合物上)。
(4)离心机离心20-30 s,将上清吸入干净离心管备用。
(5)使用200 ul Washing Buffer 清洗珠子-抗体-抗原复合物3次,即轻柔重悬、离心去上清3次。
(6)100 ul Washing Buffer 重悬珠子-抗体-抗原复合物,将混悬液移至干净EP管。
5)洗脱目的抗原
(1)将EP管离心,去上清。
(2)加20 uL Elution Buffer,轻柔吹悬复合物,避免产生气泡。
(3)室温旋转孵育2 min,分离复合物。
(4)EP管离心,将上清放吸入新EP管备用。
完成《WB实战指南》后,朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚;当时不得不回绝。因为,WB指南是基于这些年的回复的汇总,基本上方方面面的问题都有提及,只需要做些串联;而论及
coIP,目前在国内还不太普及,尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此,再想写这么个长篇颇耗时间,于我的时间和精力太为难;不过,今天是个特殊的日子,凑凑热闹吧。——人,如果在某些方面成功了,必然在另外一面有亏欠,也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧,当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎!扯远了
玩coIP也玩了5年多了,因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化(假定IP A蛋白)而非检测B蛋白的有无,说句吹牛皮的话,在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段,所以,对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测,所以部分实验操作非常苛求;学会这个,其他就是小菜了;所以,这也算一个进阶篇。
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如《WB指南》,在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡,那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致;如果细胞有大量凋亡或死亡,可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液,一般可以把误差控制在WB的检出范围以下,基本保持样品的均一;组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。
裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的,原配方如下:20mM Tris/HCl, , 100mM NaCl, 20mM KCl,
MgCl2, % NP-40 and protease inhibitors( PMSF)
此裂解缓冲液裂解条件相对温和,适合后续的coIP分析。
“不过”用它做coIP有明显的缺陷;
要理解此配方的缺陷,我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。
伪造结果,也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者,从技巧上来讲,如果要想获得设定、预想的相互作用结果,可以从几个角度着手——此类结果可重复。
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很多蛋白复合体对盐浓度敏感,但敏感