具体步骤:,最后洗涤完成后吸干PBS液。(1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)。:用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下,,EP管插冰上,置于水平摇床上缓慢晃动15min。℃,14000g离心15min。。,用PBS液洗两遍珠子,然后用PBS液配制成50%浓度。*为避免操作中破坏琼脂糖珠,减掉移液器枪头的尖部分。(50%),EP管插冰上,置于水平摇床上4℃摇晃10min。*目的是去除非特异性杂蛋白,可降低背景。℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中。,可选用Bradford法做蛋白标准曲线。,分装,-20℃保存,可保存1个月。。。℃缓慢摇动抗原抗体混合物,可选择过夜或室温放置2h。,摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。,去上清,收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。。-抗原抗体复合物悬起,轻轻敲打混匀。。,收集剩余琼脂糖珠。,电泳前应再次煮5min变性。-20℃,留待以后电泳。基础成分(1)Tris-HCl(防止蛋白变性的缓冲液成分)(2)NaCl(防止非特异性蛋白聚集的盐分)(3)NP-40(用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂,用于提取蛋白)(4)去氧胆酸钠(用H2O配置成10%储存液;提取蛋白用离子去污剂;避光保存)*因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失,准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠。
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