免疫共沉淀步骤.docx

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在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。
Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA—起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Inp下不会解体。具体如，-，。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。
很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP，这大大增加了假阳性的几率一一很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得'设定的”相互作用的有效手段。
。现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GSTpulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱疑心的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。
在《WB指南》里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别〔其实也是一种相互作用〕那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜外表受体也不稀奇。
—类外表活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。
NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助''预期"目的。
实际上，掌握a、b两点技巧，基本上可以''无往而不胜"一彻底搞定一切''想要的"相互作用。
基于以上的原因，如果想获得切实可靠的相互作用数据，那么裂解液的选取相当讲究。
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盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂〔或离子〕形成沉淀，诸如SDS，因此在某些情况下，钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提〔非破膜的温和裂解〕效率也较差，可能会丧失部分信息；而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，——。。
小技巧：最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上，纯化蛋白时，假设用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丧失较多；所以，一般如前所述。当然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利。
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