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多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备及效价测定
多克隆抗体的制备步骤
一、器材
剪刀 (剪兔毛用 )一把、弯头眼科手术镊子 (游离血管用 )一把、直头眼科手术剪 (剪血管用 )一把 ,手术刀架 ,手术刀片 ,注射器 (1ml 、
10ml,25ml) 附针头 ,兔子固定架 ,灭菌三角烧瓶 (200ml) 或平皿 (直径 18cm) 、弯头止血钳四把 ,直头止血钳两把 ,手术缝合线 ,塑料放血管 , 纱布等。
二、试剂
生理盐水 (或 PBS)
弗氏完全佐剂 (Freund ’s complete adjuvant, FCA)
弗氏不完全佐剂 (Freund ’s incomplete adjuvant, FIA)
二甲苯 ,酒精棉 ,脱脂棉 ,2% NaN3
三、免疫原 :蛋白或 KLH 偶联的多肽。每次免疫 100-200 μg 免疫
原。
四、兔子的选择
兔子的重量应在四斤以上 ,两耳光滑 ,明显可见耳静、动脉 ,健康。
五、免疫
多克隆抗体的制备方法
用生理盐水稀释免疫原 ,然后与相应的佐剂进行 1:1 混合。抗原与
佐剂完全混合形成稳定的乳剂 ,将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进
行皮下注射与后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用 1/4 的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
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抗原注射以前需要收集一些正常血清 ,已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定 ,大概需要四天左右时间 ,可以进行耳动脉取血。取血量约 5ml 足矣。
免疫用的抗原必须纯化 ,否则影响抗体的质量。抗原经 FCA 或 FIA 充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后 ,置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化 ,乳化过程比较费时、费力 ,但若乳化不充分 ,会影响免疫的效果 ,振荡后 ,1000rpm 离心一分钟 ,如水相与油相不分层即可注射。首次免疫用 FCA,以后都用 FIA 。
免疫方法可采用背部多点注射法。 即于家兔脊柱两旁选 4-6 点皮下注射 ,每点注 0、1ml, 间隔 2 周后再于上述部位选不同点注射 (不要选择临近位点 ,否则溃疡愈合不好 )。每次免疫的抗原量约 100 μg 。免疫次数在四五次即可 ,抗原用量大可以减少次数。
六、取血 :
免疫一周后 ,可以耳动脉取血检测抗体效价。 因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低 ,头两次取血 ,够检测用即可。在三次免疫后 ,可
多克隆抗体的制备方法
以获得较高效价的抗体 ,每次取血量可以在 40ml, 不要取太多 ,否则会造成兔子贫血。
前几次取血用 19 号针头对兔子进行耳动脉取血 ,室温过夜析出血清。
最后一次取血可以采用颈动脉放血 ,具体操作如下 :
1、家兔仰卧于兔架上固定头部 ,用纱布