毛竹抗病phewrky1基因克隆和功能的分析.pdf

学位论文毛竹抗病 PheWRKY1 基因的克隆与功能分析中国·北京学位论文作者崔晓伟指导教师姓名 高健研究员申请学位级别硕士专业名称林木遗传育种研究方向植物抗逆分子生物学论文答辩日期 2011 年 6 月万方数据 Dissertation for the Degree Isolation and Functional Characterization of PheWRKY1 Gene Related to Disease Resistance in Moso Bamboo Candidate: Cui Xiaowei Supervisor: Prof. Gao Jian Academic Degree Applied for: Master Degree Speciality: Forest Tree ics and Breeding Date of Defence : June, 2011 Degree-Conferring-Institution: Chinese Academy of Forestry 万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名: 日期: 年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定,中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签名: 年月日年月日学位论文作者毕业联系方式工作单位: 联系电话: 电子邮件: 通讯地址、邮编: 万方数据 I 摘要植物在长期进化过程中形成了一个复杂的调控体系来抵御病害胁迫的影响,包括本身保护性生理屏障以及一系列抗病相关基因的诱导表达。仅存在于植物中的 WRKY 转录因子基因,构成转录因子超家族,广泛参与植物抗逆反应以及多种生理代谢过程。为了探讨 WRKY 转录因子基因在毛竹中的作用,本研究从毛竹( Phyllostachys edulis ) 中克隆了一个 PheWRKY1 基因,对其编码蛋白的氨基酸序列及其表达特性进行了分析,并将其在拟南芥( Arabidopsis thaliana ) 中增强表达,对所获得的转基因株系的抗病性进行了初步研究。通过 RT-PCR 技术, 克隆得到 PheWRKY1 基因。序列分析表明, 该基因全长 1080 bp , 包括一个 579 bp 开放阅读框, 编码一个由 193 个氨基酸组成的蛋白质, 相对分子量为 KDa ,等电点为 ,基因注册号为 GU944762 。序列分析表明, PheWRKY1 基因的氨基酸序列含一个 WRKY 结构域和一个锌指结构 C 2 H 2 ,属于 WRKY Ⅱ亚组。 PheWRKY1 基因编码蛋白的保守元件与禾本科植物甘蔗、水稻、小麦、黑麦草等有很高的一致性,在 86% 以上, 与拟南芥中 AtWRKY51 同源性达 47% 。经生物信息学软件预测得知, PheWRKY1 蛋白定位于细胞核内,蛋白的三级结构与禾本科植物黑麦草类似,并且该蛋白具有转录调控和信号转导等功能。对毛竹实生苗进行多种胁迫和诱导处理,提取叶片总 RNA ,用实时定量 PCR 方法分析目的基因表达模式。结果表明,外施抗病信号分子水杨酸( SA )和茉莉酸( JA )均可以诱导 PheWRKY1 增强表达,但前者增强幅度更大,保持时间更长;紫外线 B 辐射也能诱导基因增强表达;外施脱落酸( ABA )和干旱胁迫, PheWRKY1 表达无明显变化。野外毛竹林中感染毛竹丛枝病与枯稍病样本中 PheWRKY1 基因表达也有所增强。提示 PheWRKY1 可能通过水杨酸和茉莉酸转导途径参与病原菌诱导的信号传递,而不参与对渗透胁迫的反应。为研究 PheWRKY1 基因能否与顺式作用元件的 W 盒结合,构建了 PheWRKY1 基因的原核表达载体,将其转入 pET-28a ,并使重组质粒 pET -WRKY 在大肠杆菌中经 IPTG 诱导得到了有效的异源表达。万方数据 II 对 PheWRKY1 基因构建植物过表达载体并转化模式植物拟南芥,目前已经得 T2 代转基因株系。转基因植株表现出不同的形态学特征,根