弓形虫病和广州管圆线虫病免疫学诊断研究.pdf

第一军医大学
博士学位论文
弓形虫病和广州管圆线虫病的免疫学诊断研究
姓名:李华
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:陈晓光
20050523
弓形虫病和广州管圆线虫病的免疫学诊断研究博士研究生:李华摘要指导教师:陈晓光教授第一篇基于鞍椎墓纬鍱试剂盒的构建及应用博士学位论文曜佳G宓募弓形虫对人类危害严重。诊断在弓形虫病的防治中非常重要。而目前从诊断标准、检测指标到市售试剂盒的检测效果都存在着争议和差距。其重要原因之一在于所采用的虫体粗抗原成份复杂且难以标准化。弓形虫主要表面抗原悄壳肮谕庋芯拷隙嗟木哂星棵庖咴的优势诊断分子,本室前期工作已实现了在大肠杆菌的可溶性表达,且证实其具有良好的免疫反应性。本文在此基础之辛艘韵卵芯浚标准血清的确定是评判试剂盒质量的前提,本研究采用免疫电镜技术确定免疫兔血清、单克隆抗体和正常兔血清中针对膜抗原的抗体的有无,并以此作为标准参考虹清,建立玻片虫体酶联染色试验和免疫印迹试验方法;用和确定了一批弓形虫虸抗体阳性和阴性血清,为评价基于重组抗原的弓形虫检测试剂盒提供了可靠的标准血清。纬鎟蛋白的表达、纯化及鉴定标准化试剂盒的构建需要规模化生产抗原,以摇菌方式获得目标蛋白因较难避免抗原的批间差异而满足不了需要。本研究比较了摇菌、普通发酵和高密度发酵止ひ丈刈楣纬嬷饕1砻婵乖璴谋泶锪亢筒俊=
收血清处理难以达到理想的水平;②高纯度的融合型籈检测方案的还蛋一引起的;③高纯度的融合型瓻检测方案可以通过硫氧还蛋白弓形虫特异性固寮觳馐约梁斜曜蓟囊G蟆畆特异性固寮觳馓逑档慕摘要果炙衲勘甑鞍椎谋泶锪烤季宓鞍プ笥摇R【⑵胀ǚ⒔秃透呙度发酵所获得日标蛋白产量分别为/.疞和/8呙芏确⒔捅普通发酵的成本低,,满足规模化生产的要求。为探索慷榷约觳庑Ч挠跋欤狙芯坑肗狽层析、—阄龊颓薪捍炕热执炕桨附信湮楹吞跫呕淖罴汛炕痡:艺。甈湍悍治鼋峁允荆壕璑狽一步纯化,纯度为.%;经—蚐簆狦两步纯化,纯度为.%;经—颓薪毫讲酱炕慷任ァ为鉴定这止ひ沾炕膔在觳庵械男Ч狙芯糠直鹩谜止ひ沾炕目乖籈板,检测标准血清,结果显示:经—徊纯化的牒种工艺纯化的抗原相比,敏感性无统计学差异,但特异性显著低于后帧狽和—阄隽讲酱炕沼隢颓胶法两步纯化工艺相比,不仅操作简便、成本较低,而且可实现规模化。因此,我们采用该方法批量纯化了晒κ迪至藃蛋白的中试牛产与纯化。⒀扒蟊利的解决方案,本研究用弓形虫速殖子可溶性抗原、不同纯度的融合型和经肠激酶切割后的非融合型鞍滓约熬宓鞍谆蛄蜓趸沟鞍孜展的血清组合成镋检测方案。结果表明;①低纯度的融合型籈检测方案的特异性较高纯度的融合型瓻低,并且通过大肠杆菌预吸特异性较非融合型籈检测方案低,结果表明这是由硫氧预吸收血清处理而达到与非融合型籈相同、且较天然虫体抗原好的理想效果,而且这种方案的成本较低。结论:高纯度的融合型梢源锏
=峁允荆和每构纬鎙浓度包被澹虎诖种不同配方的封闭液中挑选效果最佳者对抗原板进行封闭;③根据抗原板在不同条件下存放不同时间后的检测效果,从植煌测例普查血清,计算骄岛蚐云骄祒甀E卸媳曜迹弓形虫固逖粜蕴崾窘诟腥荆盟僦匙涌乖⒌腎检测方法易受类风湿因子等因素干扰而现非特异性反应。,结果显示:籈与—拿舾行韵嗤籈较—奶匾煨愿摺L崾荆簉用于弓形虫固的检测优于天然的虫体抗原,这为用菇ü纬鎙抗体标准化检测试剂盒提供了依据。近年来,有报道认为用捕获法检测弓形虫固孱耘除固宓纫蛩氐母扇哦岣呒觳庑堋1疚挠米罴寻慌ǘ鹊难蚩谷薎包被澹⒎直鹨詒和速殖子可溶性抗原作结合抗原,分别以标记的兔抗弓形虫蚐タ寺】固和魑=岷峡固澹与湮榻现胨僦匙涌乖湮樾Ч茫籝蘼凼怯雛还是与弓形虫速殖予抗原配伍,反应的值及疦比值均较低;在与抗原的配伍中,值较高;而和联合与湮槭保琌岛蚉/比值均为最高。,结果显示:狤的特异性与籈相同,但其敏感性较汀=∩希艘幌盗兄谱鞴ひ盏挠呕孩僖宰罴寻配方的保护剂中挑选最佳者对抗原板进行保护处理;④从植煌浞降难G稀释液挑选疦值最高且值大于者作为试剂盒的血清稀释液;⑤采用棋盘法从植煌浞降南∈鸵河朊附岷衔锏呐ǘ妊≡褡罴颜咦魑J约梁械拿附合物;⑥用棋盘法确定试剂盒的血清和酶结合物的作用时间和洗涤条件;⑦检并经多次重复测定的变异系数制定试剂盒的临界值参考血清;⑧配以阴阳性参考血清、稳定的浓缩洗涤液、底物液、显色液和外包装盒;构建—
摘要试剂盒的应用:和籌—觳馐约梁小试剂盒的性能: