TNFRIBPFc融合蛋白治疗肥胖相关的胰岛素抵抗及其机制的研究硕士论文.pdf

华中科技大学
博士学位论文
TNFRIBP-Fc融合蛋白治疗肥胖相关的胰岛素抵抗及其机制的研
究
姓名:梁慧芳
申请学位级别:博士
专业:分子免疫学
指导教师:李卓娅
20070501
华中科技大学博士学位论文

TNFRIBP-Fc 融合蛋白对肥胖相关的胰岛素
抵抗的效应
博士研究生:梁慧芳
博士生导师:李卓娅教授
华中科技大学同济医学院免疫教研室

中文摘要
当今肥胖发病率越来越高,已经成为世界上普遍的社会问题之一。肥胖与胰
岛素抵抗密切相关,是非胰岛素依耐型糖尿病发病的高危因素之一。胰岛素抵抗
(insulin resistance , IR) 是指机体对一定量胰岛素的生物学反应低于正常水
平,即胰岛素敏感性下降,常伴随 2 型糖尿病、脂代谢异常、高血压及心血管疾
病,将之统称为胰岛素抵抗综合征,又称 X 综合征。
TNF-α是由激活的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等分泌的细胞因子,介导炎症反
应、免疫应答、抗肿瘤等多种生物学效应。近来发现脂肪组织也合成和分泌 TNF-
α,它在胰岛素抵抗的发生机制中起关键性作用。已知 TNF-α可通过胰岛素受
体底物-1(IRS-1)丝、苏氨酸磷酸化抑制其酪氨酸磷酸化,从而抑制胰岛素的
信号转导,这个效应究竟是 TNFRI 或 TNFRII 介导的,现在尚无定论。
本室前期工作从噬菌体 12 线肽库中筛选出 TNFRI 封闭肽(blocking
peptide,BP),它可与分泌型 TNF-α竞争性结合 TNFRI,发挥拮抗 TNF-α的作用,
为了增加该肽的亲合力和延长其半衰期,我们将该肽的核苷酸序列插入到分泌性
表达 IgG1Fc 段的真核表达载体 pIG/3C,得到 TNFRIBP 和人 IgG1Fc 融合蛋白的
表达载体 pIG/3C-TNFRIBP-Fc。本课题用该载体与带 neo 筛选标记的
III
华中科技大学博士学位论文
共转染 CHO-K1 和 BHK-21 建立稳定细胞系,得到大量纯化的融合蛋白用于治疗肥
胖相关的胰岛素抵抗,为开发治疗 TNF-α相关疾病的肽类药物奠定基础。
一、TNFRIBP-Fc 融合蛋白的稳定表达与纯化
:分别将 pIG/3C-TNFRIBP-Fc 和 pIG/3C-IgG1Fc 载体和带有
G418 筛选标记的 载体共转染 CHO-k1 和 BHK-21 细胞,经 G418 筛选,
挑取高表达株,经三次有限稀释,得到七株稳定表达 TNFRIBP-Fc 融合蛋白的细
胞系,三株稳定表达 Fc 蛋白的细胞系。
Fc 蛋白的纯化:无血清扩大培养这些细胞株,收集上清,经 protein
A-Sepharose CL-4B 亲和层析,得到纯化的融合蛋白和 Fc 蛋白,经双抗体夹心
ELISA 定量,证实 TNFRIBP-Fc 融合蛋白的平均表达效率约为 500ng/ml,Fc 蛋白
的平均表达效率约为 400ng/ml。
-PAGE 鉴定融合蛋白和 Fc 蛋白的分子量:SDS-PAGE 显示纯化后的融合蛋
白的分子量为 37kD 左右,Fc 蛋白的分子量大约是 36kD。
:间接免疫荧光和 MTT 试验证实融合蛋白能
特异性结合鼠细胞系 L929 细胞上的 TNFRI,且 160ng/ml 的融合蛋白就可完全阻
断 TNFRI 介导的 100U/ml 的分泌性 TNF-α(sTNF-α)引起的细胞毒效应。
二、TNFRIBP-Fc 融合蛋白的体外试验
3T3-L1 分化成脂肪细胞:前脂肪细胞系 3T3L1 先用
IBMX、1μM 地塞米松和 10μg/ml 的胰岛素诱导三天,再用 10μg/ml 的胰岛素
诱导两天,撤去胰岛素培养两天,诱导其分化成脂肪细胞的效率达 90%以上。
:用不同浓度的葡萄糖作用上述分化的脂
肪细胞 24 小时,结果显示 25mM 的葡萄糖即可诱导分化的 3T3-L1 发生胰岛素抵
抗,表现为在胰岛素刺激下对 3H-2-脱氧葡萄糖的摄取降低 150 倍左右(p<)。
TNF-α与高糖诱导脂肪细胞胰岛素抵抗的关系:用不同浓度的葡
萄糖作用上述分化的脂肪细胞 24 小时,结果显示与 15mM 葡萄糖作用组相比,25mM
葡萄糖诱导胰岛素抵抗时,脂肪细胞表面 TM-TNF-α表达从 %降至 %,
而培养上清中 s