生物工程 本科 基因实验.docx

基因工程试验绿色荧光蛋白( GFP )在 E· coliBL21 中的表达前言绿色萤光蛋白(green fluorescent protein) ,简称 GFP ,这种蛋白质最早是由下村修等人在 1962 年在一种学名 Aequorea victoria 的水母中发现。分子质量为 26kDa ,由 238 个氨基酸构成,其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光(第 65 ~ 67 位氨基酸(Ser-Tyr-Gly) 形成发光团,是主要发光的位置)。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+) 可产生交互作用。其发光团的形成不具物种专一性,发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定,对多数宿主的生理无影响,是常用的报道基因。应用: 1. GFP 作为报告基因 GFP 作为基因报告可用来检测转基因效率,把 GFP 基因连接到目的基因的启动子之后,通过测定 GFP 的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。 2. GFP 作为融合标签 GFP 最成功的一类应用就是把 GFP 作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用,或者靶向标记某些细胞器。 pH 野生型 GFP 和其许多突变体都具有依赖于 pH 的荧光变化,因而可以被用来检测活细胞内的 pH 。 检测卤素离子 YFP ( H148Q )变体不但对 pH 敏感而且对不同离子也同样敏感,故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递[ 17 ]。 , GFP 可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为 Ca2+ 指示剂[ 18 ]。 6. GFP 在细胞生物学上的应用 GFP 具有同宿主蛋白构成融合子的性质,利用这一性质,可以将 GFP 定位到特定的细胞器和膜系统中,进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测, 或直接应用于定量分析。 7. GFP 在筛选方面的应用 1). GFP 用于细胞的筛选基于 GFP 的荧光特性,并且荧光稳定以及检测方法快速、方便, GFP 在细胞筛选上得到应用广泛。2). GFP 用于药物的筛选利用 GFP 对目的物进行标记,追踪 GFP ,分析目的物在细胞中的变化情况,如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化,从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物。 试验仪器 离心管, 管, 1mL 吸头, 100uL 吸头, 10uL 吸头, 1mL 移液器, 100uL 移液器, 10uL 移液器,电泳仪,三角瓶,试管,烧杯,量筒,记号笔, IPTG ,氨苄青霉素, TAE 缓冲液及其配制,琼脂糖凝胶板及其制备。 试验试剂大肠杆菌菌株: E. coli JM109 ; E. coli BL21 质粒: pCAMBIA 还有 GFP 基因,作为模板; pMD19-T 克隆载体( T载体),用于 PCR 产物的克隆; pET21b 大肠杆菌中的表达载体,表达外源基因用。培养基: LB 液体培养基, LB 固体培养基。试剂: taqDNA 聚合酶, T4DNA 连接酶,氨苄青霉素,限制性内切酶: EcoRI , HindIII ; IPTG ;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),大肠杆菌感受态( takala ,大连宝生物公司);琼脂糖, TAE buffer , PCR 相关试剂: 10Xbuffer , dNTP , Mg2+, H2O 。:用 pCAMBIA 载体作为模板----PCR 扩增 GFP 基因---- DNA 电泳检测有无 PCR 产物----PCR 产物和 T载体连接---- 转化大肠杆菌 JM109 ,涂 菌液和氨苄青霉素于 LB 平板, 37C 培养过夜---- 含重组质粒( pMD18T-GFP )阳性克隆的筛选---- 阳性菌株接种 5mL LB 液体试管----37C 培养过夜---- 提质粒(质粒提取试剂盒) ----- 酶切质粒( EcoRI/HindIII ),同时将 pET21b 载体做同样双酶切---- 电泳观察---- 回收 pET21b 载体和 GFP 基因片段(胶回收试剂盒) ----GFP 和 pET21b 连接---- 转化大肠杆菌 JM109 ,涂 菌液和氨苄青霉素于 LB 平板, 37C 培养过夜---- 挑取阳性克隆---- 接种 5mL LB 液体试管, 37C 培养过夜---- 提质粒----- 转化大肠杆菌 BL21----- 涂 菌液