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超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase ,简称 SOD )的测定方法 2009 年12月08日16:17 法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品(如生鱼片、动物血等初加工肉制品)、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶, 测酶活方法很多,本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。(一)氮蓝四唑法 1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下,核黄素受光激发,与电子供体反应被还原。在氧气中,还原的核黄素与氧化反应产生, 将无色(或微黄)的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭, SOD 通过催化歧化反应, 生成 O2 与 H2O2 , 从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的 50% 为一酶活单位。酶活力越高,抑制 50% 蓝色形成所需酶量越少。 2. 仪器荧光灯管。离心机。分光光度计。 pH 计。 3. 试剂(1) 磷酸氢二钾( K2HPO4 · 3H2O ), 磷酸二氢钾( KH2PO4 ), 甲硫氨酸( Met ), 氮蓝四唑( NBT ), 核黄素, 乙二胺四乙酸( EDTA ), 以上试剂均为分析纯级; 所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。(2) , × 10-2mol/L 的 K2HPO4- KH2PO4 缓冲液(于冰箱中保存)。 4. 测定步骤(1 )酶液的制备:称取 5~10g 样品,加预先在冰箱中放置的上述 K 2 HPO4- KH 2 PO4 缓冲液,缓冲液的量为所用样品的 10 倍以上,在 4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆,四层纱布过滤,滤液经 4000r/min 离心 20min ,取上清液用于酶活测定。(2) 酶反应酬体系液的制备: 取上述 K 2 HPO4- KH 2 PO4 缓冲液 30ml , 依次溶入 Met , NBT , 核黄素与 EDTA ,使它们的浓度分别为 × 10-2mol/L, × 10-5mol/L, × 10-6mol/L 与 1× 10-4mol/L ,放冰箱中避光保存。(3 )测酶活在暗光下,取上述酶反应体系液 3mL ,移入试管中,试管放在一反应小室中, 反应小室壁上贴锡箔纸,应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入 25~30 μL 酶液。在 25~30 ℃下用光强 4000lx 的荧光灯管( 可用 15W 荧光灯) 进行光照, 15~20min 后, 出现颜色变化。停止光照。在 560nm 波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。 5. 结果计算以抑制蓝色形成的 50% 为一个酶活单位。按下式计算: 式中 s ——样品照光后的透光度; a ——未加酶之反应液照光后透光度; b ——未加酶之反应液照光前透光度; n ——酶液稀释倍数。样品酶活单位表示: SOD 酶活单位( U) /g 干重( g 鲜重或 g 蛋白)。 6. 注释(1 )进行照光操作时,应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。(2 )进行比色测定时,应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。(二)连苯三酚自氧化法 1. 方法提要连苯三酚在碱性条件下, 能迅速自氧化, 释放出, 生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段, 黄色中间物的积累在滞后 30~45s 后就与时间成线性关系。中间产物在 420nm 处有强烈的光吸收, 在有 SOD 存在时由于它能催化生成 O2 与 H2O2 , 从而阻止了中间物的积累,通过计算就可以求出 SOD 的活力。 2. 仪器紫外分光光度计。 pH 计。 3. 试剂(1) 连苯三酚, K2HPO 4· 3H 2O, KH 2 PO 4, HCl 均为分析纯级; 所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。(2 )连苯三酚液:用 1× 10 -2 mol/L HCl 将之配成浓度 5× 10 -2 mol/L 连苯三酚液。(3) , 5× 10 -2 mol/LK 2 HPO4- KH2PO4 缓冲液。 4. 测定步骤(1 )酶液的制备:除使用以上 K 2 HPO 4- KH 2 PO4 缓冲液外,其他同氮蓝四唑法。(2) 连苯三酚自氧化速率的测定:取 , 5× 10-2mol/LK 2 HPO4- KH 2 PO4 缓冲液, 在 25℃水浴中保温 15min , 加入 10μ L5 × 10 -2 mol/L 连苯三酚液, 迅速摇匀( 空白以 K 2 HPO4- KH 2 PO4 缓冲液代替) ,倒入光径 1cm 的比色杯内,在 420nm 波长下于恒温池中每隔 30s 测A 值一次。计算线形范围内每 1min A 的增值, 此即为连苯三酚的自氧化速率, 要求自氧化速率控制在 OD/min 左右。(3) 酶活测定: 测定方法