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如何阅读分析质粒图谱标签:图谱质粒阅读 2009-09-01 14:12 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点 Ori? 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+? ,Kan+ 多?克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 P/E? 启动子/增强子 Terms 终止信号?加 poly ( A)信号?可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。( 1) Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。( 2) tetr 可以阻止四环素进入细胞。( 3) camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。( 4) neor ( kanr )氨基糖苷磷酸转移酶使 G418 (长那霉素衍生物)失活( 5) hygr 使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点( MCS )。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活, 而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源 DN A插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10K b的外源 DN A 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位, 但启动子本身不被转录。?增强子/沉默子-为真核?基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD 序列( Rbs/AGU/SDs ): mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG (起始密码)和 SD 序列。? 转录终止顺序(终止子) /翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down - stream 有一段 GT 或 T富丰区,这 2 部分共同构成 poly ( A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAA A 的保守序列,此位点 down - stream 有一段 GT 或 T富丰区,这 2部分共同构成 poly ( A)加尾信号。?回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA ,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写) (目的基因——研究或应