第5章 基因工程基本流程 ——获取目的基因
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获取目的基因
目的基因修饰、改良
建立高效表达系统
表达调控机制研究
鸟枪法
cDNA法
PCR扩增
化学合成
基因文库
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鸟枪法（shotgun ）
用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆
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“鸟枪法”最初用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。
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鸟枪法基本程序
机械切割
片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切
片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控
部分酶切
片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
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根据外源DNA片段的末端性质、筛选方案和大小确定载体
片段大小
λ-噬菌体、YAC、BAC ……
筛选方案
克隆载体：原位杂交或限制性酶切图谱
表达载体：基因产物功能检测
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根据筛选方案确定受体：
大肠杆菌：原位杂交或限制性酶切图谱
特异基因表达受体：基因产物功能检测
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菌落原位杂交
理想的探针是筛选的决定因素
基因产物功能检测
依赖于筛选模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性
限制性酶切图谱
多次酶切筛选
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限制性酶切图谱
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