免疫学实验-凝集试验.doc

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免疫学实验-凝集试验
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1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释： ml % 石炭酸生理盐水，第2、3、 ml % 石炭酸生理盐水； ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀， ml 弃之， ml 加入第2管中， ml 加入第3管，依此类推至第4管， ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:、1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：% ml ，第6管加1: ml ，第7管加1: ml 。
4. 加抗原：% 石炭酸生理盐水作1:20稀释， ml 。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）
试 管 号
1
2
3
4
5
6
7
对 照 管
最终血清稀释度
1：25
1：50
1：100
1：200
抗 原
阳性血清
阴性血清
1：25
1：25
%石炭酸生理盐水





被检血清






抗原(1：20)








5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。
＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。
牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。
[注意事项]
1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。
2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验
1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100mL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80mL、第2格40mL、第3格20mL、第4格10mL。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。
大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40mL 和20mL ；猪、山羊、绵羊、狗用80mL和40mL。
2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。
抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。
3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。
4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作