加热对尖吻蝮蛇蛇毒与其组分免疫原性与生物毒性的影响.pdf

中文摘要 2 加热对尖吻蝮蛇蛇毒及其组分免疫原性及生物毒性的影响中文摘要背景: 血清疗法是治疗被尖吻蝮蛇咬伤患者严重症状的最主要方法。目前国内生产和供应的抗尖吻蝮蛇血清制品主要有三种类型: 上海生物制品研究所生产的液状抗蛇毒血清,成都军区疾病预防与控制中心生产的冻干抗蛇毒血清粉剂,台北国立预防医学研究所生产的抗蛇毒血清冻干粉。临床应用的抗尖吻蝮蛇蛇毒血清是通过用甲醛或戊二醛脱毒后的尖吻蝮蛇粗毒免疫动物( 马或骡)来制备的。虽然用甲醛或戊二醛处理的原毒能使免疫动物产生高低度的抗血清[1,2,3] ,但是反复用含有少量甲醛或戊二醛的溶液免疫动物不可避免地造成马的损伤。好的蛇毒减毒方法,必须使减毒后的毒素具有较高的免疫原性和较低的毒性,并能产生高效价的抗血清。到目前为止,已有多种蛇毒脱毒的技术被报道: Bicalho et al. 用氯化碘溶液滴定原毒[4] ; Freitas 和 Frezard 用脂质体包裹响尾蛇毒素原毒来减毒[5] ; 很多学者研究用γ- 射线照射毒性蛋白减毒[6,7] ; Saetang 等人用选择性热变性来减毒[8,9] 。每种技术都有它的优缺点,如用γ- 射线照射会不仅有辐射伤害而且需要昂贵的仪器,脂质体包裹的工艺比较复杂。相比之下,加热减毒是最简单的脱毒技术。特别对于分子量小于 25 kDa 的蛋白,加热减毒能明显减低其生物毒性却不改变其免疫原性[8,9] 。在制备血清抗体时,选择最佳的热变性温度以求最大的保持蛋白免疫原性和减低其生物毒性,是制备高效价抗体的一个前提。目的: 将尖吻蝮蛇蛇毒按分子量大小用凝胶分离成大小不同组分, 评估不同温度加热对不同组分免疫原性及生物毒性的影响,并且进一步研究不同组分之间的协同效应,以求选择一种简单而高效的抗原减毒方法和免疫方案。方法: 中文摘要 3 一、尖吻蝮蛇毒的分离纯化用 Sephadex G-50 凝胶层析按分子量大小分离尖吻蝮蛇毒,分别收集洗脱峰,冷冻干燥。测定各组分的 LD 50 和出血活性。二、各组分最佳减毒温度的确定 1 、测定原毒及各组分出血活性随加热减毒温度升高的变化。 2 、测定原毒及各组分免疫反应性随加热减毒温度升高的变化。 3、根据免疫反应性和出血活性,确定个样品的最佳减毒温度,即在此温度加热处理后,其出血活性明显下降,而其免疫反应性无明显改变。三、最佳减毒温度处理后样品生物毒性的变化 1 、比较原毒及组分加热前后致死活性( LD 50 )的改变。 2 、比较原毒及组分加热前后出血活性( MHD )的改变。 3 、比较原毒及组分加热前后肌肉毒性( CK )的改变。 4 、比较原毒及组分加热前后溶膜活性( YFOT )的改变。四、尖吻蝮蛇组分(峰 1 与峰 2 )之间的协同作用 1 、将等量尖吻蝮蛇毒组分分别分开或混合肌肉注射于小鼠后退腓肠肌后,记录每组小鼠的平均存活时间。 2 、将等量尖吻蝮蛇毒组分分别分开或混合肌肉注射于小鼠后退腓肠肌, 90min 后取血测量各组小鼠血清平均 CK 值。五、抗尖吻蝮蛇血清抗体的制备 1 、将加热减毒后组分分开注射免疫(峰 1/ 峰 2组)和混合注射免疫(峰 1+ 峰 2 组) 豚鼠,制备抗尖吻蝮蛇 IgG ,以未加热原毒免疫动物作为对照。 2 、检测各组血清抗体效价和中和保护动物能力( ED 50 ) 。六、统计采用独立样本 t 检验, SPSS 软件等统计分析实验数据。结果: 1、用凝胶层析将尖吻蝮蛇毒分为 3个组分,分别命名为峰 1 、峰 2 和峰 3。根据电泳迁移率计算分子量,峰 1 的主要由分子量大于 21kDa 的物质组成,峰 2 则主要由分子量小于 21kDa 的物质组成,峰 3 主要为分子量约为 30kDa 的物质组成。峰 1 和峰 2 具有较强的毒性,而峰 3 毒性较低。由于峰 3 产量少,且结构特殊(在分子量小的峰 2 之后被洗脱出来) ,故不对其进行加热减毒的研究,而通过对其理化特性作进一步的研究, 中文摘要 4 确定其主要成分为碱性磷酸酶,且纯度在 95% 以上。 2、原毒、峰 1 和峰 2 的最佳减毒温度分别为 60 ℃、 55 ℃和 60℃。通过最佳减毒温度加热处理后,其生物毒性(致死活性、出血活性、肌肉毒性和溶膜活性)明显下降, 而其免疫反应性和免疫原性却能很好的保持。 3、当峰 1 与峰 2混合后注射于小鼠腿部腓肠肌,其平均存活时间明显缩短,而且血清 CK 值则明显高于分开注射组小鼠。 4、间接 ELISA 结果显示,未加热原毒免疫豚鼠所得到的抗体滴度高于加热组分免疫豚鼠,峰 1/ 峰 2 组的抗体滴度又高于峰 1+ 峰 2 组。但是,动物保护试验显示,峰 1/ 峰 2 组的 ED 50 数值最小,即需要最少剂量的血