牛凝乳酶原基因定点突变和酶性质的研究.pdf

摘要㈣1 9㈣606㈣64 Y 凝乳酶是酸性蛋白酶,它是组成皱胃酶的一种主要成分,在反刍动物的第四胃产生凝乳酶原, 。凝乳酶在奶酪加工中应用广泛, 在奶酪生产过程中,它起着凝结牛乳、改善风味的作用。为获得高活性的凝乳酶制剂, 上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pKLACl中,构建表达质粒 pKLACl-prochymosin,通过电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799 中,乳酸克鲁维酵母GG799菌株非常适合于牛凝乳酶基因的表达。通过含1%酪蛋白的 YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌pc 。该菌株分泌表达牛凝乳酶原,,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41 kDa, 符合预期大小,酸化处理后为36kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96 h后,,这为后续的研究提供了基础。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。采用定点突变的方法来改变凝乳酶基因的碱基,此方法是依据定点突变试剂盒的方法改良而来,,体外合成突变引物, 利用高保真PyrobestDNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用Dpn 1限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,将消化产物转化大肠杆菌JMl09,随机挑选克隆进行测序和筛选、鉴定所需突变株。通过YCB和YEPDL培养基的筛选,筛选出了五个适合的突变体菌株。我们可以发现, 所有的突变体都可以产生凝乳酶,但是突变体所产凝乳酶的活性较重组菌株的酶活性低,这表明此位点的改变可能对凝乳酶的折叠影响较小,但是对催化活性的影响较大。通过结构分析发现本研究所克隆出的凝乳酶为B型,判断的标准为成熟凝乳酶在224位的氨基酸,A型凝乳酶在224位的氨基酸为天冬氨酸,B型凝乳酶在224位的氨基酸为甘氨酸。氨基酸位点的改变对B型凝乳酶的活性影响较大,突变体mpc 3-7的333位氨基酸由天冬酰胺变为亮氨酸,334位的组氨酸变为异亮氨酸,从而导致酶活性的下降,而且突变体mpc 3-7的最适温度由55"C下降到50℃。说明凝乳酶的333位$1334位的氨基酸的改变会影响酶的活性和热稳定性,但是对酸碱的敏感性没有改变。发酵液通过50%乙醇沉淀,,,已经达到电泳纯。。重组菌株pc ] U/rag,突变体菌株mpc /mg,突变体菌株mpc 3-] U/mg,各菌株都取得了较好的的纯化效果。通过对酶性质的研究发现,"0,最适pH -,/ ,最适温度为55"0,在此条件下,酶活性能达到最高;/-71拘最适pH与重组菌株相同,最适反应温度为50"0, ,其Km和 rng/。关键词:牛凝乳酶,乳酸克鲁维酵母,定点突变,牛凝乳酶纯化,酶学特性 n ABSTRACT Chymosin,the ponent ,is allacidprotease produced inthefourthstomach of ruminants intheformof isresponsible forhydrolysispeptide bond between Phe105andMet 106intheK— is allimportant industrialfinzynlewidely usedin —making,it plays aimportant roleofcondensing milkandim