工作计划 人类基因组计划.doc

工作计划 人类基因组计划.doc人类基因组计划
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了 前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展 和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。 从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为 代表的间接测序技术，到xx年，以Illumina公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generationsequencing, NGS)的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低, 基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方 向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平 的研究范围。xx年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》 杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰 腺癌的致病基因PALB2,标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的 鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS技术发现罕见弗里曼谢 尔登综合征MYH3致病基因突变和《NatGenet》发表了遗传疾病米勒 综合征致病基因。此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不 断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。xx年，《Science》杂志 将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临 床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来 越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的 遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其 临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携
带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反 应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用 正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在 临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学有着指导意义。
1、第一代测序
。1977年，FrederickSanger等发 明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技 术。xx 年，AllanMaxam 和 WalterGibert 发明了 Sanger 测序法，并在 此后的xx年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核昔三 磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate, ddNTP)缺乏 PCR 延伸所需的 3-0H,因此每当DNA链加入分子ddNTP,延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和4种含有不同的放射 性同位素标记的核昔酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不 一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体 系中，具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电 泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。
人类基因组的测序正是基于该技术完成的-Sanger测序这种直接测序 方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临 床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上
采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序 TC0F1基因可以检出多达90%的与TreacherCollins综合征相关的突变。 值得注意的是，Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引 物，进行PCR直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外 显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
因此，应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位 置，设计包括该点在内的上下游150~200bp的外显子片段引物。此外, 尽管有NGS的出现，但Sanger测序对于有致病基因位点明确并且数 量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。到 目前为止，Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准，也是NGS基 因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
值得注意的是，Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突 变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是 难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS-虽 然Sanger测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪 器以及测序条件的设定。另外，Sanger测序不能检测出大片段缺失或 拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病 还不能做出基因学诊断。