小片段基因组文库的构建.ppt

实验小片段基因组文库的构建基因文库基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后,转化宿主细胞,并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合。根据文库所用的外源 DNA 的种类的不同基因组文库 cDNA 文库载体载体把能携带外源 DNA 进入受体细胞的 DNA 分子(1)在宿主细胞内能独立复制。(2)有选择性标记。(3)有一段多克隆位点。外源 DNA 插入其中不影响载体的复制。(4)分子量小,拷贝数多。(5)容易从宿主细胞中分离纯化。常用的载体有 5类: 3. 3. 载体的种类载体的种类质粒( plasmid ) 单链 DNA 噬菌体 M13 ?噬菌体的衍生物柯斯质粒( cosmid ) 动物病毒( virus ) 基因组文库载体? P1 噬菌体载体? cosmid 黏粒载体? BAC 载体(细菌人工染色体) ? PAC 载体( P1 人工染色体) ? YAC 载体(酵母人工染色体) 各种载体的比较转化酵母 250-400 YAC 电转大肠杆菌 120-300 BAC 电转大肠杆菌 130-150 PAC 转导大肠杆菌 70-100 P1 转导大肠杆菌 30-45 黏粒导入细胞方式宿主容量( kb) 载体基因组 DNA 文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性。 N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率, f是插入片段大小与基因组 DNA 大小的比值, N是所需的克隆数。举例来说, 用 BAC 载体构建人类基因组文库, 人类基因组大小为 3 x 10 9 bp , 插入片段大小为 100kb , 希望覆盖率 99% ,那么所需要的 BAC 克隆数为 N = ln (1 - ) / ln (1 - [10 6 bp / 3 x 10 9 bp ]) = - / - x 10 -6 = 138,298 文库克隆数的确定基因组文库构建的基本流程: ?基因组 DNA 片段的制备?载体的制备?将基因组 DNA 片段连接入载体?将重组载体转入宿主细胞。 DNA 片段的制备载体 DNA 分离纯化限制酶切脱磷酸化反应 DNA 片段的制备总 DNA 分离纯化分离特定大小 DNA 片段机械剪切法酶法部分酶切完全酶切 3. 供体与载体 DNA 连接要提高重组频率,应注意连接反应体系中的总 DNA 浓度和两种 DNA 分子的分子比率。 4. 重组 DNA 分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接 DNA 分子导入宿主细胞,让其自主复制,重组 DNA 分子被扩增(重组子比率可能发生变化) 5. 基因组文库质量的评价 1)文库规模---- 随机挑取一些重组子,提取质粒 DNA ,电泳测定插入片段大小,然后根据上述公式计算文库大小。 2)重组频率---- 频率越高,质量越高,可大大减轻后续筛选基因工作量。