外泌体提取方法比较.docx

外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30r00nm的双层膜囊泡状结构 小体，可由机体多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、 神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹 水、羊水等体液中。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、 miRNAs等生物活性物质，在体参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等 生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关⑴⑵。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也 可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究 至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤，沉淀或试剂盒等方 法实现外泌体的提取分离：
1、超速离心法（差速离心） 超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所 示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广 受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质 疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量⑶。
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300 x g. 10 nun
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Xg, nun
pollot = cdl dotcis 1
supernatant
70min
pellet & ^xasomes ♦ Gonlamiiating proteins
WRshln PBS j x g. 70 min
pellet = exesomes
2、密度梯度离心
在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分 离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在L 。此法 获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。
3、超滤离心⑷
由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对 分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单 高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。
4、磁珠免疫法 外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)⑻，用包被抗标记物抗体的磁珠与 外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作 简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度 影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
5、PEG-base 沉淀法
聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中 收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利 用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗 粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外 泌体等，因此发表文章时易