脲酶测定方法.doc

脲酶测定( 比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源,它的活性可以用来表示土壤供氮能力。大多数细菌、真菌和高等植物具有脲酶。它是一种酰胺酶,能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质合量、全氮和速效氮含量呈正相关。人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤脲酶是一种酰胺酶,能促进土壤有机质分子中酰胺键的水解,因此,在富含有机质的土壤中,脲酶的活性一定高。脲酶是一种高度专性的酶,能酶促尿素的水解,因此可以测定产生的氨或二氧化碳的量,或测定基质尿素的减量,以表示脲酶的活性。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。试剂: (所用试剂至少为分析纯,水最好用高纯水) 1)甲苯 2)10% 尿素:称取 10g 尿素,用水溶至 100ml 。 3 )柠檬酸盐缓冲液( p ):184 g 柠檬酸溶于 300ml 蒸馏水; g氢氧化钾溶于 500ml 蒸馏水。将两溶液合并,用 1mol/LNaOH 将pH 调至 ,用水稀释至 1000 毫升。 4)苯酚钠溶液( ): g 苯酚溶于少量乙醇,加2 ml甲醇和 ml 丙酮,用乙醇稀释至 100 ml (A),存于冰箱中; 27g NaOH 溶于 100 ml水( B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将两溶液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100 ml 。 5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为 % ,溶液稳定。( — 100ml ?) 6)氮的标准溶液:精确称取 g硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml ,得到 1ml 含有 氮的标准液(100ppm) 。标准曲线绘制: 吸取配置好的氮标准溶液 10ml ,定容至 100ml ,即稀释了 10倍(10ppm) ( )。分别吸取该液 1,3,5,7,9, 11,13,15 ml至 50ml 容量瓶, 加水至 20ml ,再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液, 随加随摇匀, 充分摇荡,放置 20分钟显色,用水稀释至刻度。1h内将着色液在(紫外)分光光度计上于 578nm 处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图。操作步骤: 1)称取 10g新鲜土样于 100ml 容量瓶中 2)向容量瓶中加入 2 ml甲苯(以能全部使土样湿润为度)并放置 15分钟 3) 之后加入 10ml 10 %尿素溶液和 20ml 柠檬酸缓冲液( ) ,并仔细混合4)将容量瓶放入 38℃恒温箱中,培养 3h(或 37℃恒温箱中,培养 24h ) 5)培养结束后,用热至 38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上), 仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸(慢速定量滤纸) 过滤于三角瓶中。 6) 显色:吸取 3ml 滤液(可根据情况而定,比如 1ml )于 50ml 容量瓶中, 加入 10ml 蒸馏水,充分震荡,再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液,随加随摇匀, 充分摇荡,放置 20分钟显色, 用水稀释至刻度, 溶液呈现(青定) 酚的蓝