脲酶测定方法.doc

脲酶urease(水解酶):脲酶试验原理:存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。试剂:1)甲苯2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100ml。3)柠檬酸盐缓冲液():。将两溶液合并,用1mol/,用水稀释至1000毫升。4)苯酚钠溶液():,,用乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升。5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,%,溶液稳定。6)氮的标准溶液:,:吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图。取新鲜土壤7份,每份30g,装于棕色广口瓶中,先将1,3-二氯丙烯溶于丙酮(定量),,3-二氯丙烯,使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g,,然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%(记录此时重量,以便补充水分)。放置于25℃恒温培养箱,培养后第0d、1d,5d,10d(前10d密封,后来测定的敞口)、20d,30d,40d,50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前,反复旋转广口瓶,混匀土样,一个处理随机取3个重复。1)称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。2)向容量瓶中加入1ml甲苯(以能全部使土样湿润为度)并放置15分钟3)之后加入10ml10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(),并仔细混合4)将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h5)培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。6)显色:吸取3ml滤液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸馏水,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,仔细混合,再加入3ml次氯酸钠,充分