简便快速的PCR技术学习教案.pptx

会计学
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简便快速(kuài sù)的PCR技术
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依赖核酸序列(xùliè)的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA)
原理：
靶RNA经AMV逆转录，形成RNA:DNA杂交体
RNase H降解杂交体的RNA，剩下单链DNA
AMV以其为模板,合成(héchéng)含T7RNA聚合酶启动子的双链DNA
T7RNA聚合酶以其不断转录出靶RNA
进入新一轮扩增循环
产物主要为反义单链RNA、RNA:DNA杂交体和双链DNA。
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依赖核酸序列(xùliè)的扩增技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；NASBA)
特点：
可直接扩增特异性单链RNA
整个反应不需PCR仪，无需温度循环，没有高温(gāowēn)变性步骤，不会受到外来双链DNA的污染。
反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感性高。
加入变性步骤， 也能扩增双链DNA。
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环介导等温扩增技术(jìshù)(loop一mediated isothermal amplification，LAMP)
反应体系:
缓冲液
具有链置换特性的DNA聚合酶
dNTP
模板DNA
能够(nénggòu)识别靶DNA 6个特异序列的4条引物。引物为2条内引物和2条外引物
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环介导等温扩增技术(jìshù)(loop一mediated isothermal amplification，LAMP)
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哑铃(yǎlíng)状模板合成阶段
引物FIP首先和F2c结合启动(qǐdòng)互补链的合成，形成双链结构(图1b)。
F3再和F3c结合，启动(qǐdòng)链置换反应，释放出1条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构(图1d)。
这条单链DNA，又可作为模板，在另一端分别结合BIP和B3，合成1条双链，并置换出1条哑铃状的DNA(图1f)。
哑铃结构很快与其一端F1c和F1互补，而由自我引物延伸机制合成1种双链的茎环结构DNA(图1g)。这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料。
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循环(xúnhuán)反应阶段
FIP和双链茎环结构DNA(图Ig)中的环状结构结合，形成1种有缺口的过渡性茎环结构DNA，该结构在茎上含有靶序列的1个额外反向复制序列，在对面的末端，通过BIP形成1个环状结构。
在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐(zhújiàn)增加，最后的产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。
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