苹果酸发酵工程学习教案.ppt

苹果酸
L-苹果酸广泛存在于生物体中，是生物体三羧酸循环的成员。苹果酸广泛应用于食品领域。因为苹果酸具有比柠檬酸柔和的酸味，滞留时间长和口味更好的优点，所以作为食品酸味剂更为理想。
许多微生物都能产生苹果酸，但能在培养液中积累苹果酸并适合于工业生产的，目前仅限于少数几种，大致有：
用于一步发酵法的黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉；
用于两步发酵法的华根霉、无根根霉、短乳杆菌、膜睽毕赤酵母(jiàomǔ)；
用于酶转化法的短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌。
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苹果酸发酵机制
(1) 乙醛酸循环(xúnhuán)合成
（2）丙酮酸羧化合成
（3）乙醛酸循环(xúnhuán)和丙酮酸羧化合成
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一、一步(yī bù)发酵法
以糖类为发酵原料，用霉菌直接发酵生产L-苹果酸的方法称为(chēnɡ wéi)一步发酵法。
1) 菌种  一步发酵法采用黄曲霉A-114生产苹果酸。
2) 种子培养基组成(%)  C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 ，K2HPO4 ，NaCl ，MgSO4 ，CaCO3 6(单独灭菌)。
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3)种子培养  将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下并移接到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，在33℃下静置培养2~4d，待长出大量(dàliàng)孢子后，将其转入到种子罐扩大培养，接种量为5%。种子罐的培养基与三角瓶培养基的组成相同，%(体积分数)泡敌。种子罐的装液量为70%，，培养温度33~34℃，通风量（VVM）~，培养时间18~20h。
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4)发酵培养基组成  C6H12O6 7%~8%，其余(qíyú)成分的组成及用量与种子罐培养基相同。
5)发酵  发酵罐的装液量为70%，接种量10%，，培养温度33~34℃，/（)，搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。发酵过程中由自动系统控制滴加泡敌，防止泡沫产生过多。当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。
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二、两步发酵法
两步发酵法是以糖类(tánɡ lèi)为原料，先由根霉菌发酵生成富马酸(延胡索酸)和苹果酸的混合物，然后接人酵母或细菌，将混合物中的富马酸转化为苹果酸。
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1)富马酸发酵(fā jiào)
①  菌种  两步发酵法以华根霉6508为菌种生产苹果酸。
②  斜面(xiémiàn)培养  华根霉6508于葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面(xiémiàn)上，30℃培养7d，易于长出大量孢子。
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③  摇瓶发酵
a  培养基组成(%)  C6H12O6 10，(NH4)2SO4 ，K2HPO4 ，聚乙二醇10，MgSO4 ，FeCl3 ，CaCO3 5(单独灭菌)。
b  富马酸发酵  在500ml三角瓶中装入50ml培养基，灭菌，冷却(lěngquè)。接种华根霉孢子，置往复式摇床上，于30℃下培养4~5d，发酵得到含富马酸和苹果酸的混合液。
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c  转换发酵
a)  酶转化法  酶转化法是国外用来生产L-苹果酸的主要方法。酶转化法是以富马酸盐为原料(yuánliào)，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。酶转化法可分为游离细胞酶法、固定化细胞酶法。
b)  游离细胞酶转化法  酶转化方法  %富马酸的溶液中接入2%湿菌体，于35℃、150r/min条件下转化24~36h。转化率达90%以上。
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c)  固定化细胞酶转化法  研究得最多的是以产氨短杆菌(gǎnjūn)或黄色短杆菌(gǎnjūn)，将化学法合成的富马酸钠作为底物，进行固定化细胞生产苹果酸。
使用固定化细胞易于生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止这种副反应的发生。
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