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罗氏（Roche）公司Tunel试剂盒操作说明书（Insitucelldeathdetectionkit-POD法）
原理：
TUNE（LTdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂
盒是用来检测组细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，
核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）
对于培养细胞的预处理：
在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，
干燥后4℃保存；
适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集
约1M06个细胞，PBSa一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片
上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；
将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min；
④PBSS洗二次，每次5min;
⑤%的TritonX-100中处理5min；
⑥PBSS洗二次，每次5min;
后续操作如同石蜡包埋切片的6-15
四、注意事项
进行PBS清洗时，每次清洗5min。
PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后
再进行下一步反应。
在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜
膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可
以防止反应液干燥造成实验失败。
TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，
长期保存会导酶活性的失活。
如果20>DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%
）染色后，请用灭菌蒸储水清洗多余的甲基绿。然后进行
洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观
察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，
注意快速进行脱水操作。
2号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途
径进入机体，注意防护。
试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；3号液
（converter-POD）液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，
至少在6m稳定，避免再次冻存；TUNE反应液临用前配好后，放至
冰上直至使用。
结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代的组织细胞
中可产生大量DNAt断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏
DNAt裂或DNAK解不完全，以与细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞反应，进而产生假阴性结果。
常见问题的原因与推荐解决方案
现象
可能原因
建议
非特异性染色
TdT酶的浓度过高
用TdTdilutionbuffer*作1:21：10
稀释
TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。
注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能
很好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA勺断裂）
尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
在固定组织时样本DNA已断裂（源核酸酶的作用）
确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液
采用推荐的固定液
固定后某些核酸酶活性依然较高导