实验四蛋白酶活力的测定.ppt

关于实验四蛋白酶活力的测定
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一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
巩固比色法测定物质含量的基础，掌握关于实验四蛋白酶活力的测定
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一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用方法，学习绘制标准曲线的方法
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二、实验原理
1．胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，，反应10min，以每min水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
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三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计
水浴锅
Folin –酚试剂
% 酪蛋白
100 g/ml Tyr 溶液
三氯醋酸
Na2CO3
胰蛋白酶
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四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
4
5
6
样品、对照滤液（各2支试管）
100g/ml Tyr (ml)
0





每支管加1ml
水（ml)





0
稀释后Tyr浓度（μg/ml）
0
20
40
60
80
100
Na2CO3 (ml)
5
5
5
5
5
5
5
Folin-酚试剂 (ml)
1
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
A680nm
调0
A样、A对照
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
管号
酶液（ml）
酪蛋白（ml）
三氯
醋酸（ml）
40℃水
浴准确保温10分钟
三氯
醋酸（ml）
酪蛋白（ml）
40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液
样品管
1
2
----
3
-------
对照管
1
----
3
------
2
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2、蛋白酶活力的测定
按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。
滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml，40 C保温15min)
以标准曲线中的1号管调0，测定A 样 (样品液A680nm值)和A 对 (对照液A680nm值)；
管号
酶液（ml）
酪蛋白（ml）
三氯
醋酸（ml）
40℃水浴