高效液相色谱-魏芸.ppt

高效液相色谱-魏芸
1. 硅胶
结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
特性：
1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键
物质极性↑，吸附能力↑→强（流动相极性↑，Rf ↓）
高效液相色谱知识
经典LC
HPLC
柱之内径
1~5cm
~
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度
150µm~200µm
4µm~10µm
使用压力
1~10atm
50~200atm
分离时间
~天
~10min
经典LC与HPLC比较
HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便
HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器
GC与HPLC比较
GC
HPLC
流动相
惰性气体（无亲和性，只起运载作用）
气体、沸点较低的化合物
不同极性的液体（有一定亲和作用）
温 度
较高
一般室温
分析对象
高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物
高效液相色谱的固定相和流动相
（－）固定相
高效液相色谱固定相依据承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质，×108～×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，是目前最广泛使用的一种固定相。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。×108Pa。
固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。
特点：多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。
2．全多孔型固定相
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。
由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。
特点：颗粒很细（5-10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析
（二）流动相
高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。
对流动相溶剂的要求是：
（1）溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和好的选择性。
（2）溶剂要与检测器匹配。
对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～1OOnm。
（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。
(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
高效液相色谱法分类及分离机理
分配色谱—样品组分在吸附于惰性载体上的固定液和流动相之间分配系数不同
键合相色谱—样品组分在键合于惰性载体上的固定液和流动相之间的分配系数不同
吸附色谱—样品组分对固定相表面吸附力不同
体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开
离子交换色谱—不同离子与固定相上相反电荷间的作用力大小不同
亲和色谱—利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法
（一）分配色谱（partition chromatograp