重组大肠杆菌高密度养殖创新实验报告.doc

实验名称: 重组大肠杆菌的高密度发酵姓名: 学号: 学院: 专业: 指导教师: 小组成员: 2012 年6月 23日重组大肠杆菌产生长因子的高密度发酵摘要以产生生长因子的重组大肠杆菌为发酵菌, 采用分批补料方法进行高密度发酵, 从而获得大量生长因子。本实验发酵条件温度在 37℃、pH约为 7、以乳糖作为碳源、蛋白胨作为氮源,经过 h的发酵,离心收集菌体获到 菌离。目标产物分子量约为 23KDa ,在不同发酵时间下目的蛋白的表达量先增多后减少。最后通过蛋白测定得总蛋白占菌体的 % 。前言生长因子是分子量约为 23KDa 的蛋白,重组大肠杆菌可产生生长因子,以重组大肠杆菌为发酵菌,以乳糖作为碳源,又作为诱导剂来诱导其表达生长因子, 在适宜的发酵条件下进行高密度发酵,可产生大量的生长因子。该技术不仅可以减少培养体积,强化下游分离提取,还可以缩短生产周期、减少设备投资,从而达到降低生产成本,提高生产效率的目的。本实验对重组大肠杆菌进行高密度培养,优化培养、发酵条件,使所需产品在重组大肠杆菌中得以高效表达,因生长因子是胞外产物,能在胞内产生包涵体, 分离时需破碎细胞。实验中通过测定菌体浓度,绘制菌体生长曲线及还原糖测定来控制发酵过程,以达到最佳的发酵条件。发酵结束后对发酵液进行离心收集菌体,再通过 SDS-PAGE 分析判断目的蛋白的表达情况,还对总蛋白进行了测定,计算总蛋白占菌体的比例。 1 材料和方法 实验材料 重组大肠杆菌 培养基[1]平板培养基组成:蛋白胨 10 g/L ,酵母粉: 5 g/L , NaCl:10 g/L, 琼脂: 15 g/L 。 LB 培养基组成:蛋白胨 10 g/L ,酵母粉: 5 g/L , NaCl:10 g/L 。发酵培养基组成:蛋白胨: g/L ,酵母粉: g/L ,乳糖: g/L , KH 2 PO 4 : g/L , K 2 HPO 4 :4 g/L, Na 2 HPO 2 O:7 g/L, ( NH 4) 2 SO 4 : g/L , NH 4 CL: g/L 。补料培养基组成:乳糖:900 g/L ,作为碳源补料;酵母粉:40 g/L ,蛋白胨:40 g/L , 作为氮源补料。 实验方法[1,2] 种子及扩大培养:在 37°C 下将菌种在装液量为 50 mL 的300 mL 摇瓶中以 220 r/min, 振荡活化 27h,然后按取 3mL 接种量接入种子瓶中在同样条件下培养 32h。 发酵过程控制:将种子按 6% 接种量接入发酵罐中,温度为 37℃。以 pH 为指标进行补料通过 NaOH 调节,使其保持在 左右。补料以乳糖为碳源,酵母粉和蛋白胨为氮源。以上数据由计算机每 1 min 自动收集记录一次。 分析方法 菌体浓度测定: 发酵液经合适倍数的稀释后, 用紫外分光光度计在λ=600 nm 处测吸光值,其与稀释倍数的乘积即发酵液的菌体浓度(OD600 )。 生长曲线绘制:每隔一小时测一次菌体浓度,绘制成生长曲线。 细胞干重(DCW) 测定:取 20mL 发酵液, 离心(10000rpm/min,20m