测序结果分析(共8页).docx

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测序结果的判读
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测序结果的判读
，可用软件chrosmas打开，一种颜色的峰代表一个碱基，峰的高低表信号的强弱。一个正常的N表示机器没法判读是哪种碱基，原因是：杂峰的信号高于机器默认的值，机器会认为该处有两个峰，因此不能判断确定是哪个峰，需要人工判读。以下三种情况会出现N：有杂合子，有杂峰，反应已结束。
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原因：测序产物纯化不够
注意：染料峰位于序列的前 100 碱基以内;酒精峰位于序列的 220 ~ 320 碱基之间
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产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒
原因：测序反应失败。
解决办法：改进条件，重做反应。注意两个关键因素：引物与模板之间的比例： pmol: 200 ng。模板 DNA 的纯度和用量： ~
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原因：残余的 Dye 太多，纯化不够。有测序反应，但效率低下信号太弱
解决办法：纯化充分。避开引物峰，确定新的分析起点
1、PCR产物测序时出现重叠峰
问题图1(模板中有碱基缺失，往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码)
解决方法：将PCR产物克隆到质粒(如T载体)中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。
问题图2(PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一)
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解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序，便可解决。
问题图3(测序引物有碱基缺失)
测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'端缺失)，和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，