高效液相色谱仪的使用.pdf

实验八 高效液相色谱仪的使用（示教）

一、实验目的
HPLC 仪器基本结构,掌握实验仪器的一般使用方法；
，掌握主要实验条件的选择；
3. 掌握保留时间初步定性和外标法的定。
高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。反相高效液相色谱法（RP-HPLC）应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。它是采用非极性
固定相（如 C18 等）、极性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式，极性较强或亲水
的样品分子和反相柱中的固定相上的相互作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出。
本实验采用 RP-HPLC 分离模式，以紫外检测器进行检测，待测样品中不同组分分子与固定
相作用力的大小不同而产生分离，结果以色谱峰的形式进行记录。
三、仪器与试剂
仪器： Agilent HP 1100 高效液相色谱仪；紫外检测器；定量环体积 20μl；50μl 微量
注射器；超声波清洗器。
色谱柱： C18 或 C8
试剂：1．甲醇（HPLC 纯）；超纯水。
2．苯标准溶液；混合样品
四、色谱条件
流动相：甲醇:水=80:20；固定相：Agilent C8 (150 mm× mm×5 µm)不锈钢柱；
流速： ;室温；检测波长：254nm
五、实验步骤
1．开启仪器：打开计算机,并运行 Bootp Server 程序；打开 1100 LC 各模块电源；待各模块
自检完成后，双击 Instrument Online 图标，化学工作站自动与 1100LC 通讯，进入的工作站
画面。
2．排气泡：流动相过滤、脱气后使用，打开废液阀（purge 阀），开启泵（pump on），设定
流速 5mL/min 冲洗，直到输液管中无气泡为止，一般需 2-5min，降低流速关上 purge 阀。
3．条件设定：通过泵设定流动相组成、分析时间及流速；开启检测器灯源，设定检测波长；
编辑方法 method 并保存，从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，设定样品名称。
4．进样分析：预热半小时左右，等仪器 Ready，基线平稳，准备进样；先使六通阀处于装
样（load）位置，用微量注射器将样品注入定量环，快速转动手柄至进样（injection）位置，
此时仪器会输出一个脉冲，标记开始采集数据。本实验先对苯、甲苯的标准溶液逐一进样分
析，确定各自的保留时间，然后对试样溶液进行测定，确证组分，计算结果。
5．数据处理：
（1） 试样溶液中组分的定性
根据标准样品溶液的保留时间，对试样溶液中的组分进行对比定性确认。
（2） 试样溶液中组分含量的计算
根据色谱峰面积（或峰