色谱分析法--高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法
高效液相色谱法
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱仪简介
高效液相色谱分离原理
高效液相色谱固定相和流动相
毛细管电泳简介
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱与经典液相色谱
高效液相色谱与气相统
高压输液系统由溶剂贮存器、高压输液泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。
溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
高压输液泵
高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。
按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。
常用的泵有往复式柱塞泵和气动放大泵
恒流泵和恒压泵
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
往复式柱塞泵
死体积小，适于梯度洗脱；流量调节方便；
输出有波动，不适用于差示折光检测器
气动放大泵
流量输出稳定，无脉冲；
死体积大，不便于梯度洗脱；
梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：外梯度装置和内梯度装置
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
其结构和适用于气相色谱类似
分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。
填料粒度5-10m，理论塔板数大约为7000-10000
检测器
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。
对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。
有两种类型的检测器：
溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。如紫外、荧光、电导，安培检测器等；
总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。如差示折光检测器等。
紫外光度检测器
相当于一双光束紫外光度计，但光路系统比较特殊，流通池也有不同的种类
紫外光度检测器光路系统
流通池的类型
荧光检测器
灵敏度和选择性好
差示折光检测器
根据溶液折射率的变化进行检测
通用型检测器
不适用于梯度洗脱
差示折光检测器光路
电导检测器
主要用于
离子色谱
五电极电导检测器
薄层安培检测器
高效液相色谱主要类型
液固色谱
液液色谱
离子色谱
排阻色谱
分离方法的选择
液固色谱分离原理
液固色谱的固定相是固体吸附剂。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。
液固色谱适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。
液液色谱分离原理
液液色谱的固定相和流动相是互不相溶的液体，试样组分依据在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异在两相间进行分配。
与气液色谱不同，液液色谱的流动相对分配系数有很大影响。
根据出峰顺序与组分极性的关系可以将液液色谱分为正相色谱和反相色谱两类。正相色谱中流动相的极性小于固定液的极性，非极性组分先出峰。反相色谱正好相反。
普通液液色谱大都为正相色谱，而随着化学键合固定相的广泛使用，反相色谱用得越来越多。
离子色谱分离原理
用于分离离子的高效液相色谱法有离子交换色谱法，离子对色谱法和离子色谱法三类。
离子交换色谱法
离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其