高效液相色谱HPLC简介.ppt

高效液相色谱（HPLC）简介
HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) —高效液相色谱法
是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:
高性能色谱柱,高精度输液化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
液相色谱类型
色谱柱简介
正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。
反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
流动相
反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度
H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇
＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃
正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序
正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
液相色谱图相关术语(1)
色谱图相关术语:
色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生
的响应信号的微分曲线
峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线
峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离
峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰
底相交两点之间的距离
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧
相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间
的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
←色谱峰
时间(分)
基线
↓
峰高
峰宽
响应值
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语:
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响
应值
标准偏差(σ)(Standard Error):
对应峰宽的一半
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
拖尾
前伸
A B
1/10h
h
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语:
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所
产生的响应信号的曲线
基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓
慢变化
基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起
的基线波动
保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰 最大值所需的时间
流动相的选择原则
①样品易溶，且溶解度尽可能大。
②化学性质稳定，不损坏柱子。
③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。
④粘度低，流动性好。
⑤易于从其中回收样品。
⑥无毒或低毒，易于操作。
⑦易于制成高纯度，即色谱纯。
⑧废液易处理，不污染环境
提高柱效的方法
固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀
流动相粘度低
低流速
升高柱温。
评价液相色谱方法的标准
α，k'，N∶如何控制分离度?
K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。
a 是分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，是化学因素。
N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。
改变a的途径
改变固定相
改变流动相
改变温度
改变样品的本身性质
在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。