实验八 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 、DNA的Tm值测定.ppt

实验八实验八酵母核糖核酸的分酵母核糖核酸的分离及核酸组分鉴定离及核酸组分鉴定 1 1一、目的一、目的?了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。 2 2二、原理二、原理?酵母核酸中 RNA 含量较多。 RNA 可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀,由此即得到 RNA 的粗制品。?核糖核酸含有核糖、嘌呤碱,嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。 3 3三、操作三、操作?1、提取: 将2 g 酵母悬浮于 10ml 10%NacL 溶液中( 50ml 锥形瓶),经膨胀、摇匀后置 100 ℃沸水浴上加热 30min 后,冷却。离心( 3,500r/min ) 10min, 将预冷的酸性乙醇溶液以等体积倾入上清液中。注意要边搅拌一边倾入。待核糖核酸沉淀完全后,离心(3, 000r/min ) 5min 。得到沉淀物用适量的 碳酸氢钠溶液溶解后,再用 SC 溶液定容至 10ml 。 4 4 ?2、 DNA 和 RNA 成分鉴定: ?1)、嘌呤碱?取两支小试管,分别加入 和 RNA 样品溶液,然后在每支试管中加入 10% 氨水和 3混匀后,观察沉淀物及其颜色的变化 5 5 ?2)、核糖取两支试管分别加入 DNA 和 RNA 样品溶液 、二苯胺溶液 。放沸水浴中 10min 。注意溶液是否变成蓝色, 说明该方法的专一性。?3)、磷酸: 取两支试管,加入 DNA 和 RNA 样品溶液 和定磷试剂 。在水浴中加热,观察溶液是否变成蓝色,说明磷酸是否存在,两支试管的颜色的深浅度为什么有差异。 6 6四、思考题四、思考题? p43 页3、6、7 7 7实验九实验九 DNA Tm DNA Tm 值的测定值的测定 8 8一、目的一、目的?正确理解 DNA 的 Tm 值的定义及测定 Tm 值的意义; ?掌握 DNA Tm 值的测定方法; ?了解 DNA 变性、复性的机理与条件。 9 9二、原理二、原理?当DNA 在稀盐溶液中加热到 80-100 ℃时,双螺旋结构即发生解体,两链分开,形成无规则线团。与此同时发生了一系列理化性质的变化, 其中 260nm 的消光值增高(增色效应); 粘度降低;浮力密度降低等。 DNA 的这些变化是属于爆发式的,变性作用发生在很窄的温度范围内。通常把 DNA 的双螺旋结构失去一半时的温度称为该 DNA 的熔点或熔解温度( melting temperature ),用Tm表示, DNA 的 Tm值一般在 70-85 ℃之间。变性后的 DNA 在温度降低的过程中得以复性, A260nm 值再次下降到接近自然状态的消光值。 10 10