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一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用的制作方法
一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用的制作方法
一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。这种荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物；荧光`，其水解产物均具有极强的荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为:激发波长30(T400 nm，在40(T500 nm进行荧光发射谱的检测。
[0009]本发明的有益效果为:这种荧光探针为4位含有不同取代基团的7-羟基香豆素衍生物；按照比例将4-取代基香豆素与三乙胺混合，再滴加丙烯酰氯酰氯，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应半胱氨酸含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中半胱氨酸含量的定量测定。这种应该探针具有高特异性，可以与半胱氨酸特异性环化后水解，即7位酯键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，具有具有良好的荧光发射光谱特性(400~500 nm)，通过绘制标准曲线进行半胱氨酸定量测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图14-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的1H-NMR谱图。
[0011]图24-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的13C-NMR谱图。
[0012]图34-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的高分辨质谱。
[0013]图44-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应后荧光强度变化结果。
[0014]图54-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应后紫外吸收变化结果。
[0015]图6 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与不同氨基酸反应后荧光变化结果O
[0016]图7 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与不同浓度半胱氨酸反应后荧光强度变化曲线。
[0017]图8 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素为探针与半胱氨酸反应荧光强度变化与时间的关系。
[0018]图9细胞共聚焦成像图，图中由左到右分别为探针加巯基捕捉剂、探针、亮场。
[0019]图10 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成路线。
【具体实施方式】
[0020]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0021]实施例1 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的化学合成 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成步骤如下:
(1) mmol的4-三氟甲基-7- mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，30 mmol的丙烯酰氯酰氯(溶于5 mL的四氢呋喃中)，控制温度在0°C ；
(2)冰浴条件下搅拌Ih后，将溶液温度升至室温，搅拌过夜。；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1: 3 v/v)进行洗脱，得44mg白色固体粉末；
实施例2 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素对于不同氨基酸的选择性
(I)预先准备99 μ?代谢反应体系，包括pH (10 mM):乙醇(体积比9:1)，L-丙氨酸(50 μ M)、L-精氨酸(50 μ M)、L-天门冬酰胺(50 μ M)、L-天门冬氨