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限制酶的多种切割方法
一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性尾端
单酶切
1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这是最简。
4）单酶切的长处与弊端。单酶切长处就是操作简单。它的弊端主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连结酶作用下易自己环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的双侧各有一个黏性末
端，并且是相同的尾端，所以这两个尾端会发生碱基互补配对而使目
的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，此中质粒又
恢复成没有切割前的样子。②目的基因与质粒的随意连结：因为目的
基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，假如载体和目的基因的
酶切是使用同一种限制酶，那么目的基因的插入就有两种可能了。一
种可能是目的基因的最前端恰好插在启动子毗邻下游，这样能够正确
表达；另一种恰好相反，目的基因的尾端插在启动子的毗邻下游（也
就是将目的基因翻转180度以后插入进去的），目的基因则没有方法
表达。这样就简单形成两种重组DNA分子，此中一种重组DNA分子是
我们所需要的，这样就加大了挑选工作量。因而可知，将同一种限制
酶切割目的基因与质粒能够获取两种重组质粒，不可以使质粒与目的基
因发生定向连结。
多酶切
（1）用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段
和运载体。较常有的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA
片段和运载体，二者都会产生拥有两种不一样的黏性尾端的DNA片段
（两个尾端分别用A与B表示），而后混淆起来，那么载体分子的A
端与目的基因的A端连结，载体分子的B端与目的基因的B端连结，
这就形成了重组DNA分子。此外，还能够用不一样组限制酶同时去切割
含目的基因的DNA片段和运载体，此时要用同尾酶或同裂酶去切割。
【例2】（2009年福建理综）：转基因抗病香蕉的培养过程如
下列图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切
割位点。请回答：
建立含抗病基因的表达载体A时，应采纳限制酶，对进行切割。
分析：题中抗病基因的双侧分别是PstⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，
所以只好用这两种酶去切割。目的基因双侧的黏性尾端是P和E，为
了让目的基因与运载体联合，运载体双侧的黏性尾端也只好是P和E，
所以也只好用PstⅠ和EcoRⅠ酶去切割质粒。不可以独自使用SmaⅠ酶
去同时切割目的基因与质粒的原由是SmaⅠ的酶切位点正幸亏目的基
因的中间，假如独自用此酶切割会损坏目的基因的构造。所以，答案
是采纳限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对含抗病基因的DNA片段与质粒进行切
割。
2）多酶切的优弊端。多酶切的长处是能够战胜单酶切的两大弊端，