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限制酶的多种切割方法
一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体——形成黏性末端
单酶切
（1） 同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这 是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶 作用下形成相同的黏限制酶的多种切割方法
一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体——形成黏性末端
单酶切
（1） 同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这 是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶 作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对 而连接，进而形成重组DNA分子。
（2） 用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来 源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂 酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏 性末端。
2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamH I与Bst I）,其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限 制性内切酶可以切割，另一种则不能。
（3） 用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来源 不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同,但能产生相同的黏性 末端，这类酶被称为同尾酶。常用的限制酶BamH I、Bglll、Bell 和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核 苷酸组成的黏性末端。显而易见，由同尾酶所产生的
DNA片段，是能 够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。
【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶I的识别序列和 切点是—G ； GATCC—,限制性内切酶II的识别序列和切点是一（GATC ―。在质粒上有酶I的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶II的 切点。
请画出质粒被限制酶I切割后所形成的黏性末端。
请画出目的基因两侧被限制酶II切割后所形成的黏性末端。
在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏 性末端能否连接？为什么？
解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够 连接起来。
③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间 能发生碱基互补配对而连接。
（4） 单酶切的优点与缺点。单酶切优点就是操作简单。它的缺 点主要有两个:①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自 身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末 端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目 的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状
DNA分子，其中质粒又 恢复成没有切割前的样子。②目的基因与质粒的任意连接：因为目的 基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，如果载体和目的基因的 酶切是使用同一种限制酶，那么目的基因的插入就有两种可能了。一 种可能是目的基因的最前端刚好插在启动子邻接下游，这样可以正确 表达；另一种刚好相反，目的基因的末端插在启动子的邻接下游（也 就是将目的基因翻转180度之后插入进去的），目的基因则没有办法 表达。这样就容易形成两种重组DNA分子，其中一种重组DNA分子是 我们所需要的，这样就加大了筛选工作量。由此可见，将同一种限制 酶切割目的基因与质粒可以获得两种重组质粒，不能使质粒与目的基 因发生定向连接。
多酶切
（1）