石斛总DNA提取.pptx

石斛总DNA提取
步骤
一、材料
二、DNA提取方法
三、DNA检测
四、注意事项及改进方法
材料
实验共用两种石斛,其一是铁皮石斛,其二是霍山石斛。均采自于霍山县太平畈乡。
DNA提取方法
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1、打开水浴锅,检查水位,调节温度至65℃,预热2x CTAB提取缓冲液;
2、取干燥25-50 mL 离心管中,加入灭菌的磁珠在球磨机上粉碎组织;
3、向管内加入900 μL预热(65℃)的CTAB提取缓冲液,再加入10 μL(1d)β-巯基乙醇和少许PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),置于65℃水浴保温40-90 min,其间翻动摇2-3次混匀;
DNA提取方法
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4、冷却至45℃以下,加等体积的氯仿/异戊醇,温和摇动使之混匀,使成乳状液。室温,12000 rpm离心10min;
5、静置分层后,将700μL上层清液吸入另一干净的EP管中,加入700μL氯仿/异戊醇,温和摇动使之充分混匀。室温,12000 rpm离心10 min;
6、吸取500 mL Ep管中,加入330 μL异丙醇(约占上清液的2/3体积),-20℃放置30 min;
7、高速冷冻离心机调至4℃,12000 rpm离心10 min,弃上清;
8、加入500 μL 70%乙醇,12000 rpm离心5 min,弃上清。重复操作一次;
9、加入500 μL无水乙醇, 12000 rpm离心5 min,弃上清。重复操作一次;10、小心弃去上清,用吸水纸吸干乙醇,管口水平放置。37℃烘箱15-30 min待乙醇挥干。
11、加入适量50 μL灭菌水,溶解DNA,4 ℃保存;
12、 %的琼脂糖凝胶(含染料),取2μL加至3μL 6× LoadingBuffer中,点样,电泳检测DNA,凝胶成像仪上观察。检测后的DNA放置-20 ℃保存供后期实验用。
实验的问题
在石斛总DNA提取过程中常出现杂质干扰DNA纯度的现象,如含有酚类杂质的DNA沉淀物多成黄色或者褐色难以溶解于TE液或双蒸水中。
石斛由于含有较多的多糖,因此在提取中多糖常与DNA一起沉淀,这种沉淀会难溶与水因此会影响PCR扩增。
实验所采用的改良版CTAB法步骤多,操作繁杂,容易在实验过程中被外源DNA所污染。
改进方法
为了得到质量较高的总DNA在选取材料时尽量选取幼嫩的叶组织。
DNA对剪切力极为敏感,为了得到尽可能大的片段,在提取过程中药尽量简化操作步骤如减少转移DNA次数,离心时间等。
提取过程中应温和操作,避免剧烈震荡。用较粗枪头吸取上清液时注意不要产生气泡。